Диссертация (1141319), страница 8
Текст из файла (страница 8)
При низких концентрациях недостигаетсянеобходимогоразделениякатионовмагнияинатрия,присутствует нестабильность базовой линии. При высоких концентрацияхпроисходит значительное возрастание шума, наблюдается нестабильностьбазовой линии, потеря эффективности в результате избыточного джоулеваразогрева и нарушается разделение катионов кальция и натрия.3.1.2. Подбор оптимального значения pH.Первоначально для приготовления буфера использовалась уксуснаякислота, однако были обнаружены искажения аналитического сигнала длянизких концентраций ионов калия. После замены уксусной кислоты намуравьиную такие искажения не наблюдались.Значение pH буферной системы определеялось pKa муравьинойкислоты (pKa = 3,75, для обеспечения максимальной буферной емкости истабильности системы), а так же pKa имидазола и определяемых веществ(должны быть ионизированы).Для исследования зависимости эффективности разделения от pH былапроанализирована смесь катионов с использованием буферных систем сразличными значениями pH.
Полученные данные представлены на рисунках7 и 8.56Рисунок 7. Зависимость электрофоретического поведения исследуемыхкатионов от pH.В диапазонах pH 3,0 - 3,5; 4,5 - 6,0 наблюдалась нестабильностьбазовой линии. При возрастании pH наблюдается уменьшение временмиграции, вследствие увеличения скорости электроосмотического потока.Хотя данное явление можно рассматривать как позитивное, при значенияхpH от 4.0 и выше наблюдалось уменьшение буферной емкости и, вследствиеэтого, усложнение титрования для получения необходимого значения pH, чтоприводит к ухудшению робастности системы.57кЧТТ600000кЧТТ для катионовкалия500000400000кЧТТ для катионовкальция300000кЧТТ для катионовнатрия200000кЧТТ для катионовMg100000кЧТТ для катионов Li02,53,54,55,56,5pHРисунок 8. Зависимость кажущегося числа теоретических тарелок (осьординат) от pH. Использовались средние значения трех определений длякаждого типа буфера.Изменение значения pH не оказывало существенного влияния на кЧТТисследуемых катионов, за исключением катионов магния – параметрувеличивался при росте pH, пока значение не составило более 5,5, после чегопроисходило его уменьшение.3.1.3.
Дополнительная оптимизация рабочего буферного раствора.Поскольку, при капиллярном зональном электрофорезе в рабочембуфере, состоящем только из имидазола и муравьиной кислоты, непроисходит разделения катионов калия и катионов аммония, как возможнойпримеси,добавляли18-краун-6эфир.Былоисследовановлияниеконцентрации 18-краун-6 эфира (0; 0,32; 1; 1,5; 2; 2,5; 4 ммоль/л) наразделение катионов и относительные времена миграции. Полученныерезультаты представлены на рисунках 9 и 10 соответственно, а также вприложении 2.58кЧТТ200000кЧТТ для катионовкалия180000кЧТТ для катионовкальция160000140000кЧТТ для катионовнатрия120000100000кЧТТ для катионовмагния8000060000кЧТТ для катионовлития40000кЧТТ для катионоваммония20000001234ммоль/дм3Рисунок 9.
Влияние концентрации 18-краун-6 эфира (ось абсцисс) начисло кажущихся теоретических тарелок (ось ординат).tв-ва/tстанд.0,850,8катионы аммония0,75катионы калиякатионы кальция0,7катионы натрия0,65катионы магния0,60,55024ммоль/дм3Рисунок 10. Влияние концентрации 18-краун-6 эфира (ось абсцисс) наотносительные величины времен миграции (tв-ва/tстанд., ось ординат).На рисунках 9 и 10 видно, что 18-краун-6 эфир селективно уменьшаетэлектрофоретическую подвижность катионов калия, что приводит к ихразделению с катионами аммония.Поприведенным данным можно сделатьвывод отом, чтоконцентрация 18-краун-6 эфира около 2 ммоль/л является достаточной для59необходимого разделения катионов калия с другими исследуемымикатионами.Таким образом, оптимальный состав рабочего буферного раствора (налитр) для определения катионов можно определить как: 15-20 ммольимидазола, 2 ммоль 18-краун-6 эфира, кислоты муравьиной до pH 3,6, водыдеионизированной до 1 л.3.1.4.
Количественное определение.При количественной оценке использовалось соотношение площадипика ко времени миграции, поскольку исследуемые ионы мигрируют сразной скоростью и, вследствие этого, могут проводить разное количествовремени в зоне детектирования.Для уменьшения отклонений количественных результатов проводиласьих коррекция по внутреннему стандарту (катионам лития) - в расчетахиспользовались приведенные соотношения площадей пиков к временаммиграции относительно внутреннего стандарта.Расчет содержания катионов проводили по уравнению линейности,получаемому при калибровке (зависимость концентрации от получаемогоскорректированного соотношения площади пика к времени миграции).Скорректированноеотношениеплощадипикаквременимиграцииопределяли по формуле: где Cst - концентрация внутреннего стандарта в пробе, мкг/мл; Sst полученная площадь пика внутреннего стандарта на электрофореграмме; Si полученная площадь пика исследуемого катиона; tst - полученное времямиграции внутреннего стандарта, мин.; ti - полученное время миграцииисследуемого катиона, мин.603.2 Тест пригодности электрофоретической системы дляопределения катионов.Электрофоретическая система считалась пригодной, если выполнялисьследующие условия:• При анализе стандартной смеси отсутствовали пики неизвестногохарактера в диапазоне времени от 2 минут до 9 минут.• Сохранялся следующий порядок миграции катионов: катионы калия,кальция, натрия, магния, лития.• Разделение всех катионов происходило до базовой линии.• Факторы ассиметрии пиков не превышали 5,99 для катионов калия;4,05 для катионов кальция; 3,06 для катионов натрия; 0,42 для катионовмагния; 0,35 для катионов лития.• Ожидаемое соотношение времени миграции катионов к временимиграции внутреннего стандарта составляло около: 0,586 для катионовкалия; 0,635 для катионов кальция; 0,769 для катионов натрия; 0,802 длякатионов магния.• Число кажущихся теоретических тарелок не было значительно нижеследующих значений: для катионов калия – 39344, катионов кальция – 79804,катионов натрия – 119899, катионов магния – 212545, катионов лития –83135.3.3 Валидация методики идентификации и количественногоопределения катионов.Оценка разработанной методики была проведена согласно ОФС 420111-09 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента»и [4].
Методика была провалидирована по следующим параметрам:специфичность, линейность, сходимость, правильность.613.3.1Валидацияиметрологическаяоценкаметодикидлякачественного и количественного анализа растворов для инфузий.Оценка специфичности.Специфичность – это способность аналитической методики даватьправильный результат определения вещества в присутствии сопутствующихкомпонентов.Специфичность методики проверялась исследованием модельнойсмеси,содержащейнекоторыедругиелекарственныевещества,встречающиеся в лекарственных препаратах вместе с исследуемымикатионами (рутин, фолиевая кислота, рибофлавин, аскорбиновая кислота,никотинамид, ретинола ацетат, токоферолаацетат), а также частоиспользуемые вспомогательные вещества (целлюлоза, крахмал, глюкоза,фруктоза, лактоза, сахароза).
Полученные электрофореграммы представленына рисунке 11.Рисунок 11. Результаты исследования специфичности методики. Сверху- электрофореграмма смеси катионов калия, кальция, натрия, магния,лития. Снизу - электрофореграмма смеси возможных сопутствующих ивспомогательных веществ.62По результатам исследования можно сделать вывод, что присутствиеперечисленных выше веществ в пробе не оказывало влияния на определениеисследуемых катионов.Оценка линейности.Линейностьметодики–этоналичиелинейнойзависимостианалитического сигнала от концентрации или количества определяемоговещества в анализируемой пробе в пределах аналитической областиметодики.Определениелинейностипроводилосьпошеститочкамсконцентрациями в диапазоне, характерном для проб, получаемых в ходеподготовки для анализа растворов для инфузий. Полученные результатыпредставлены в таблице 10 и рисунках 12-15.63Таблица 10.
Результаты исследования линейности.№массараствора,гмассарастворастандарта,гмассаводы, гплощадьпикаионаплощадьпикалитиявремямиграциииона, минвремямиграциилития,минрасчитаннаяконцентрация,мг/лрасчитаннаяконцентрациялития, мг/лскорректированноесоотношениеплощади пика ковремени миграции14,3215,4016,9018,1619,4820,729,969,8410,1710,1710,2110,421,7461,8832,0462,1592,2982,4977,378,709,3410,0210,6611,239,9610,1710,1710,2110,429,901,7822,0132,2092,3752,5632,683238,36256,47281,40324,28345,04363,559,969,8410,1710,2110,429,9062,7266,6971,1378,9484,9986,60Результаты для ионов калия1234561,2251,3391,4481,5571,6681,7820,1960,1960,2000,2000,2010,2068,5768,6168,3578,2568,1368,05421,7723,8325,7731,0029,5332,70187,53188,50194,03221,13199,03206,933,913,923,933,943,943,945,905,945,965,975,985,98Результаты для ионов кальция1234561,22531,44761,55691,66821,78151,88230,19570,19990,20,20060,20550,19588,57618,3578,25568,13598,05437,991326,6330,5038,2036,8040,5045,87187,53194,03221,13199,03206,93212,634,684,734,754,754,764,775,905,965,975,985,985,99Результаты для ионов натрия1234561,22531,33861,44761,66821,78151,88230,19570,19630,19990,20060,20550,19588,57618,61558,3578,13598,05437,9913984,071063,831130,471282,471408,371553,23187,53188,50194,03199,03206,93212,634,924,954,964,994,995,005,905,945,965,985,985,9964Продолжение таблицы 10.
Результаты исследования линейности.№массараствора,гмассарастворастандарта,гмассаводы, гплощадьпикаионаплощадьпикалитиявремямиграциииона, минвремямиграциилития,минрасчитаннаяконцентрация,мг/лрасчитаннаяконцентрациялития, мг/лскорректированноесоотношениеплощади пика ковремени миграции2,663,143,373,614,054,299,9610,1710,1710,219,9010,210,6980,8090,8400,9221,0161,064Результаты для ионов магния1234561,2251,4481,5571,6681,8821,9860,1960,2000,2000,2010,1960,2018,5768,3578,2568,1367,9917,83611,3713,3315,8015,5318,8717,83187,53194,03221,13199,03212,63198,175,115,155,165,175,185,185,905,965,975,985,996,0065Сx, мг/л22,000График линейности для ионовкалияy = 8,8542x - 1,1377R² = 0,993621,00020,00019,00018,00017,00016,00015,00014,0001,5001,7001,9002,1002,3002,5002,700скорректированное Sx/txРисунок 12.
Калибровочный график для катионов калия. Полученноеуравнение прямой: y=8,8542x-1,1377, коэффициент достоверностиаппроксимации 0,994.График линейности для ионовкальцияСx, мг/л11,50011,000y = 4,1176x + 0,2034R² = 0,991410,50010,0009,5009,0008,5008,0007,5007,0001,6001,8002,0002,2002,400скорректированное Sx/tx2,6002,800Рисунок 13. Калибровочный график для катионов кальция. Полученноеуравнение прямой: y=4,1176x+0,2034, коэффициент достоверностиаппроксимации 0,991.66Сx, мг/л385,000365,000345,000325,000305,000285,000265,000245,000225,00060,000График линейности для ионовнатрияy = 5,1015x - 82,021R² = 0,994365,00070,00075,00080,00085,00090,000скорректированное Sx/txРисунок 14. Калибровочный график для катионов натрия.
Полученноеуравнение прямой: y=5,1015x-82,021, коэффициент достоверностиаппроксимации 0,994.Сx, мг/лГрафик линейности для ионовмагния4,0003,500y = 4,3827x - 0,3866R² = 0,99523,0002,5000,6500,7500,8500,9501,050скорректированное Sx/txРисунок 15. Калибровочный график для катионов магния. Полученноеуравнение прямой: y=4,3827x-0,3866, коэффициент достоверностиаппроксимации 0,995.Оценка сходимости.Сходимостьметодикихарактеризуетсярассеяниемрезультатов,получаемых с ее использованием, относительно величины среднего67результата.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
