Диссертация (1141319), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Электрофорез вгомогенной буферной системе при унифицированной напряженности поляявляется стандартным методом, который особенно эффективен приразделении малых молекул с постоянным зарядом. Поэтому он являетсянаиболее пригодным для разделения неорганических ионов, алифатических иароматических карбоновых кислот, сульфокислот, аминокислот, фенолов,нуклеотидов и аминов [10; 27; 66].Изотахофорез.При изотахофорезе все компоненты пробы движутся с одинаковойскоростью. Однако из-за проблем выбора конкретных электролитов иограничений в выборе детекторов (применимы только детекторы поэлектропроводности) этот метод невозможно использовать в качестветочного аналитического метода.
В случае ИТФ проба вводится между двумяэлектролитами с различными подвижностями ионов, выбранными так, чтобыони ограничивали подвижности компонентов пробы. Обычно ведущийэлектролит обладает наивысшей, а конечный электролит - наиболее низкойподвижностью из всех движущихся ионов. После достижения стационарногосостояния все одинаково заряженные ионы движутся с одинаковымискоростями. В каждой зоне при ИТФ имеется своя напряженность поля.34Внутри каждой зоны напряженность поля постоянна, изменения происходятскачком на границах зон.
По этой причине методом ИТФ разделяли толькоанионы или катионы. ИТФ преимущественно применяют для разделениянеорганических ионов и органических карбоновых кислот. Из-за проблемдетектирования и трудностей, связанных с нахождением подходящихэлектролитов, для проб неизвестного состава метод ИТФ неприменим. ИТФ,также как вытеснительная хроматография, способен концентрироватьразбавленные пробы, поэтому он может быть использован на стадиипредварительного концентрирования перед разделением методом КЭ. Этимразрешаются проблемы, связанные с дозировкой относительно большихобъемов разбавленных проб [10; 27; 64; 66].Мицеллярная электрокинетическая хроматография.С помощью данного метода проводится разделение незаряженныхкомпонентов пробы за счет различной вероятности нахождения их в водной(подвижной) и псевдостационарной (мицеллярной) фазах.
При добавлении кбуферу детергентов при превышении их критической концентрациимицеллообразования образуются мицеллы, которые обладают гидрофобнымхарактеромвнутриизаряженыснаружи,чемидостигаетсяихэлектрофоретическая подвижность в электрическом поле. В зависимости отзнака заряда эта электрофоретическая подвижность направлена в сторонукатода или анода.
МЭКХ может быть реализована в той же аппаратуре, что иКЗЭ и требует лишь добавок детергента. Наиболее часто в качестведетергента используется додецилсульфат натрия. Получаемые мицеллыимеютотрицательныйзарядиприобретаютэлектрофоретическуюподвижность в направлении анода. По аналогии с КЗЭ эффективная скоростьперемещения компонентов пробы, так же, как и мицелл, представляет собойвекторную сумму электрофоретической и электроосмотической скоростей.Если вклад электрофоретической подвижности мицелл меньше вкладаэлектроосмотической подвижности, то мицеллы движутся в сторону катода,т.е. в сторону детектора.
Полярные молекулы, которые задерживаются35только в водной фазе, движутся со скоростью электроосмотического потокаи, спустя «мертвое» время, достигают детектора. Сильно гидрофобныемолекулы пробы задерживаются прежде всего внутри мицелл и движутся соскоростью мицеллы. Вследствие того, что молекулы пробы взаимодействуютс псевдостационарной фазой, точность метода МЭКХ соответствует точностиобычногохроматографическогометода.Значениенагрузочногокоэффициента k', по аналогии с хроматографией, можно определить каксоотношение между числом молекул пробы в подвижной и стационарнойфазах. В отличие от ВЭЖХ, в данном случае через детектор могут проходитьтакже молекулы пробы полностью связанные с псевдостационарной фазой.Для определения «мертового» времени в качестве инертных маркеровподходят: ацетон; формамид или метанол - взаимодействием которых смицеллами можно пренебречь и которые движутся со скоростью ЭОП.
Вдальнейшем эти вещества можно детектировать с помощью УФ-поглощенияили изменения показателя преломления как пик показателя преломления. Вкачестве маркера для определения времени миграции мицелл находятприменение такие водорастворимые соединения, которые задерживаютсятолько внутри мицелл, например, судан III и судан IV [10; 27; 66].Область применения метода МЭКХ не ограничивается толькоразделением нейтральных веществ, им можно разделять и заряженныепробы. Распределение веществ между водной и мицеллярной фазами можетприводить к росту селективности и воздействовать тем самым на разделениеионов с очень схожими электрофоретическими подвижностями. В этихслучаях разрешение пиков, достигаемое методом МЭКХ, превышаетразрешение КЗЭ. Данный метод можно использовать для определениянекоторых металлов после образования комплексов [60; 62; 65].1.3.1.5 Капилляры и их кондиционирование.Идеальныйматериалкапиллярадолженбытьхимическииэлектрически инертным, а также прозрачным в ультрафиолетовой и видимой36областях спектра.
Чаще всего в качестве материала капилляра используетсякварц. Однако данный материал является весьма хрупким, поэтомуиспользуетсяполиимидноепокрытие,чтозначительноулучшаетэксплуатационные характеристики капилляра. Для обеспечения возможностиобнаружения веществ с помощью спектрофотометрического детектора, накапилляре делается оптическое окошко (удаляется полиимидное покрытие) вместе прохождения луча. Альтернативным материалом для капилляровявляется тефлон. Он прозрачен в ультрафиолетовой области спектра и,поэтому, специального окошка не требуется.
Хотя на поверхноститефлонового капилляра нет заряда, электроосмотический поток тожеоказывается значительным. Кроме того, трудно получить капилляры сравномерным внутренним диаметром; отмечаются трудности, связанные садсорбцией образца (аналогичные встречающимся при работе с кварцем);тефлон обладает плохой способностью к теплопередаче. Эти недостаткиограничивают его область применения. [52]Обычно используются капилляры с внутренним диаметром 25 - 75микрон и внешним диаметром 350 - 400 микрон. Если исходить изпотребности сокращения продолжительности анализа, следует применятьсамые короткие капилляры.
Диапазон эффективной длины капилляровсоставляет от 10 см (для капилляров, заполненных гелем) до 100 см(капиллярыдляразделенийпометодукапиллярногозональногоэлектрофореза). Наиболее часто пользуются капиллярами, имеющимиэффективную длину 50 - 75 см [27; 52].В связи с использованием капилляров со столь малым диаметромодной из основных проблем в капиллярном электрофорезе являетсяконцентрационная чувствительность. В сравнении с ВЭЖХ путь лучадетектора является приблизительно в 12-20 раз меньшим и пределобнаружения уменьшается примерно в 100 раз. Для улучшения пределовдетектированияиспользуютсякапиллярыспузырькомвместе37детектирования (увеличение оптического пути в 3 раза) или применяютсяспециальные кюветы (увеличение оптического пути в 10 раз) [27; 52].Одним из решающих факторов, дающих хорошую воспроизводимость,является кондиционирование капилляра, что является одной из наиболееважных проблем высокоэффективного капиллярного электрофореза.
Условиянаибольшей воспроизводимости обеспечиваются, когда кондиционированиепроводится только буфером. Однако поступать так, часто не позволяютадсорбцияобразцанаэлектроосмотическогоповерхностипотока.капилляраНаиболееичастоизмененияиспользуюткондиционирование щелочью (для удаления адсорбировавшихся веществ идля обновления поверхности за счет снятия протонов с силанольных групп).Могут использоваться следующие способы промывки [10; 27]:1.Промывка рабочим буфером - самый простой способ промывки,который удаляет из капилляра остатки образца и обновляет рабочийбуферный раствор, чтобы избежать эффекта истощения буфера. Во многихслучаях данная процедура является достаточной для получения постоянногоЭОП и очистки капилляра.2.Приложение напряжения - данный шаг может стабилизироватьЭОП. Также приложение напряжения противоположного напряжению вовремя анализа может удалить сорбировавшиеся на стенке частицы.3.Короткие промывки водой могут быть использованы дляразделения несовместимых растворителей, например при риске выпаденияосадка компонентов при их контакте.
Также эта процедура может бытьиспользована для смягчения перехода pH.4.Промывка щелочью используется при необходимости болеежесткой обработки капилляра, например при работе с концентрированнымиобразцами или веществами, сильно сорбирующимися на стенке капилляра.Однако данный тип промывки несовместим со всеми типами покрытийкапилляра и не рекомендуется для использования при работе с рабочимибуферными системами, обладающими низкими значениями pH.385.Промывкатакимикислотамикакфосфорнаяилихлористоводородная также обеспечивает более жесткую обработку чем водаили рабочий буферный раствор, однако без депротонирования силанольныхгрупп стенки капилляра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
