Диссертация (1141275), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Изучение специфической активности ЛФОпределение антимикробной активности ЛФМетод серийных разведенийРезультаты антимикробной активности для всех исследованных образцовпредставлены в таблице 29.Таблица 29Microsporumcanis 352Candida albicansATCC 10231ATCC 9027PseudomonasaeruginosaProteus vulgarisATCC 6896Escherichia coliATCC 25922Объектыисследованияaureus 209 P№п/пStaphylococcusАнтимикробная активность ЛФ в опытах in vitroРазведение/концентрация (в пересчете на эвкалимин в мкг/мл)1Микроэмульсияна основе МЦ1:16/781:4/3121:8/1561:2/6251:2/6251:4/3122Микроэмульсияна основе АН1:64/19,51:8/1561:8/1561:4/3121:4/3121:8/1563Плацебо1:21:21:21:21:21:8Мицеллярныйраствор на основеМЦ1:4/3121:2/6251:4/3121:4/3121:2/6251:4/312Мицеллярныйраствор на основеАН1:4/3121:2/6251:4/3121:4/3121:2/6251:4/312АН(вспомогательноевещество)2000200020002000н/а20002000Нипагин(консервант)100010001000100010001000(микроэмульсияна основе АН)456796Таким образом, установлено наличие антимикробной активности вотношении всех изученных штаммов патогенных микроорганизмов, при этомнаиболее высокая бактериостатическая активность выявлена у образца № 2 вотношении Staphylococcus aureus 209-P в разведении 1:64 (19,5 мкг/мл впересчете на эвкалимин), в отношении Esherichia coli АТСС 25922, Proteusvulgaris ATCC 6896) и Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027 в разведении 1:4-1:8(312-156 мкг/мл в пересчете на эвкалимин).Наиболее высокое фунгистатическое действие выявлено у того же образца№ 2 в отношении Microsporum canis 3/84 в разведении 1:8 (156 мкг/мл) иумеренное – в отношении Candida albicans АТСС 10231 в разведении 1:4 (312мкг/мл).Метод диффузии в агар использован для выявления поведения исследуемойЛФ на наносимую поверхностьА) Нанесение исследуемых образцов ЛФ на поверхность агараПри нанесении образцов ЛФ непосредственно на поверхность застывшегоагара установлено, что микроэмульсии на основе АН и МЦ (№1, №2) оказывалибактериостатическое действие, подавляя рост грамположительных бактерийStaphylococcus aureus АТСС 6538 (209-P) в дозе 0,5 мл на чашку Петри (46,3мкг/см2в пересчете на эвкалимин), мицеллярные растворына основе АН и МЦ (№3 и №4) оказывали частичную задержку роста в дозе 0,5 мл (в области зоны −отдельные колонии), образцы № 5- 8 (плацебо) не обладали бактериостатическойактивностью (Таблица 30).Таблица 30Антимикробная активность ЛФ, содержащих растительные экстракты эвкалимини эстифан, при нанесении на поверхность чашки ПетриЗона задержки роста микроорганизмов, ммStaphylococcus aureus 209 PХарактеристикаисследуемыхобразцовДоза 0,2 мл(18,7 мкг/см2в пересчете наэвкалимин)Доза 0,5 мл(46,3 мкг/см2 впересчете наэвкалимин)Candida albicans ATCC 10231Доза 0,2 мл(18,7мкг/см2 впересчете наэвкалимин)Доза 0,5 мл(46,3мкг/см2 впересчете наэвкалимин)971(микроэмульсия наоснове МЦ)множественные отдельныеколонииростотсутствуетсплошной ростсплошнойрост2 (микроэмульсия наоснове АН)множественные отдельныеколонииростотсутствуетсплошной ростсплошнойрост3 (мицеллярныйраствор на основе АН)сплошнойрост4 (мицеллярныйраствор на основе МЦ)сплошнойрост5 (плацебо –микроэмульсия наоснове МЦ)сплошнойростсплошной ростсплошной ростсплошнойрост6 (плацебо –микроэмульсия а наоснове АН)сплошнойростсплошной ростсплошной ростсплошнойрост7 (плацебо –мицеллярный растворна основе МЦ)сплошнойростсплошной ростсплошной ростсплошнойрост8 (плацебо –мицеллярный растворна основе АН)сплошнойростсплошной ростсплошной ростсплошнойростмножественныеотдельныесплошной ростколониимножественныеотдельныесплошной ростколониисплошнойростсплошнойростВ отношении дрожжеподобных грибов Candida albicans АТСС 10231 ниодин из образцов в изученных дозах активностью не обладал.Б) Метод «лунок»Установлено, что плацебо № 1 – 4 (с нипагином) и № 5 – 8 (без нипагина)бактериостатической и фунгистатической активностью в дозе 0,2 мл/лунка необладают (Таблица 31).Таблица 31Антимикробная активность плацебо («метод лунок»)Зона подавления роста, ммStaphylococcus aureusCandida albicansХарактеристика209 PATCC 10231исследуемых образцовДоза 0,2 мл на лунку98№ 1 (плацебо с нипагином)00№ 2 (плацебо с нипагином)00№ 3 (плацебо с нипагином)00№ 4 (плацебо с нипагином)00абвРисунок 23.
а - зоны подавления роста Staphylococcus aureusэкспериментальными составами ЛФ (№№1 и 2 – микроэмульсионная форма;№№3 4 – мицеллярная форма); б-отсутствие зон задержки роста Staphylococcusaureus плацебо с нипагином; в - отсутствие зон задержки роста Staphylococcusaureus плацебо без нипагина.Таким образом, проведенные исследования антимикробной активности ЛФ,содержащихрастительныеэкстрактыэвкалиминиэстифан,ввидемикроэмульсии и мицеллярного раствора показали, что образцы микроэмульсии(образец №2) на основе АН наиболее активна в отношении грамположительныхбактерий рода Staphylococcus.Исследование противовоспалительной активности ЛФОпределяя влияние на скорость ферментативной реакции, катализируемойиндуцибельной NО-синтазой in vitro различных доз ЛФ, установлено достоверноеингибирование скорости iNОS-реакции в присутствии раствора растительныхэкстрактов на 27-32% независимо от концентрации по сравнению с контролем.Полученные данные свидетельствуют о высокой противовоспалительнойактивности ЛФ в концентрациях от 2 мг/мл до 0,2 мг/мл.99Достоверно установлено увеличениепротивовоспалительного эффектапрепарата при низких концентрациях, о чем свидетельствуют полученныерезультаты (Таблица 32).Таблица 32Изменение скорости ферментативной реакции, катализируемой индуцибельнойNО-синтазой in vitro, в зависимости от концентрации ЛФВарианты опытаКонтроль (плацебо)Эстифан (р-р 2 мг/мл)Эвкалимин (р-р 2 мг/мл)Эстифан + Эвкалимин (2мг/мл+2 мг/мл)(1 мг/мл + 1 мг/мл)Скорость ферментативной реакциииндуцибельной NO-системы (М ±m)мкмоль НАДФН/ мг Соотношениебелка в мин.опыт/контроль (%)1,205 ± 0,0211000,456 ± 0,028370,960 ± 0,039800,880 ± 0,0280,736 ± 0,0230,826 ± 0,030(0,1 мг/мл + 0,1 мг/мл)736168Исследование иммуностимулирующей активности ЛФПроводилисравнительнуюколичественнуюоценкувеличиныактивирующего влияния изучаемых объектов на скорость НАДФН-оксидазнойреакции in vitro.
При этом, соотносили скорость реакций в экспериментальныхпробах, со скоростью НАДФН-оксидазной реакции в пробе, содержавшейизвестныйприродныйиммуноактиваторпротимозин-α(кислыйбелок,выделенный из тимуса крысы), принимая ее за 100%.Отдельно проводили изучение влияния растительных экстрактов эвкалимини эстифан на скорость НАДФН-оксидазной реакции (Таблица 33).Таблица 33Зависимость скорости НАДФН-оксидазной реакции в опытах in vitro от вида иколичества исследуемых объектовСкорость НАДФН-оксидазной реакции, M±mВариант опытанмоль/мин на 10 мкл гомогената%Контроль00100Протимозин- α69,8±0,75100,0Растительный экстрактэвкалимин 3,3 мкг/мл20,3±0,6329,0Растительный экстрактэвкалимин 6,6 мкг/мл13,6±0,5719,5Растительный экстрактэстифан 3,3 мкг/мл3,0±0,104,3Растительный экстрактэстифан 6,6 мкг/мл13,5±0,5519,3ЛФ образец 1 (10 мкл)6,7±0,229,6ЛФ образец 1 (20 мкл)9,3±0,3513,3ЛФ образец 2 (10 мкл)22,2±0,8231,8ЛФ образец 2 (20 мкл)17,0±0,1624,4ЛФ образец 3 (10 мкл)7,5±0,2410,7ЛФ образец 3 (20 мкл)2,0±0,072,9ЛФ образец 4 (10 мкл)19,3±0,8127,7ЛФ образец 4 (20 мкл)12,5±0,4517,9Kaк видно из полученных результатов, скорость НАДФН-оксидазнойреакции контрольной пробы была равна 0.
При добавлении к гомогенатупротимозина-α происходит активация НАДФН-оксидазы, которая окисляется соскоростью 69,8 нмоль/мин на 10 мкл гомогената. Это значение принимали за100%.При добавлении растительного экстракта эвкалимин в концентрации 3,3мкг/мл в пробу скорость окисления равнялась 20,3 нмоль/мин на 10 мклгомогената, что составляет 29% от эффекта протимозина-α.Внесение растительного экстракта эстифан в концентрации 6,6 мкг/млприводило к активации НАДФН-оксидазной реакции, скорость которой составила13,5 нмоль/мин на 10 мкл гомогената или 19,3% от протимозина-α.101При добавлении к гомогенату ЛФ – максимальное иммуностимулирующеедействие наблюдали у образца №2 (микроэмульсия на основе альгината натрия),который при внесении 10 мкл увеличивал скорость НАДФН-оксидазной реакциина 24,4%, апри внесении 20 мкл ЛФ в систему – на 31,8% от эффектапротимозина-α.Таким образом, установлено наличие наибольшей иммуностимулирующейактивности у образца №2 (микроэмульсия на основе альгината натрия).Указанный состав микроэмульсии, с учетом его специфической активностипо сравнению с другими исследованными образцами ЛФ выбран нами какокончательный и условно назван «Эстилин».3.10.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
