Диссертация (1140658), страница 7
Текст из файла (страница 7)
ПР – полная ремиссия, ЧР – частичная ремиссия, МПО - медианапродолжительности ответа.Дальнейшие исследования эффективности этого комбинированноголечения желательны еще и потому, что недавние исследования выявилимолекулярный механизм его действия: усиление независимого апоптоза р53 взлокачественных Т-лимфоцитах по JAK1 сигнальному пути и нормализацияэкспрессии CTACK/CCL27 [88, 116].43Анализируя источники литературы, можно прийти к выводу, что,несмотря на имеющийся арсенал методов диагностики, до сих порсуществуют трудности в диагностике грибовидного микоза, особенно наранних стадиях, отсутствуют общепринятые диагностические критерии.Стоит отметить, что диагноз ГМ может быть установлен лишь на основаниикомплексной оценки клинического обследования пациента, результатовгистологического, молекулярно-генетического и иммуногистохимическогометодов исследования.Кроме того, отсутствует однозначность в подходах к лечению больных,что обусловливает необходимость усовершенствования методов терапии.44ГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯРабота выполнена на базе кафедры кожных и венерических болезнейим. В.А.Рахманова и Лаборатории медицинской генетики Институтамолекулярной медицины ПМГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России(Сеченовский Университет).2.1 Общая характеристика больныхПод нашим наблюдением находилось 50 больных, из которых было 27больных грибовидным микозом и 23 больных бляшечным парапсориазом,получавших терапию на базе клиники кожных и венерических болезней им.В.А.РахмановаПМГМУим.И.М.СеченоваиФедеральногогосударственного бюджетного учреждения «Национальный медицинскийисследовательский центр гематологии» (ФГБУ «НМИЦ гематологии») впериод с 2016 по 2018 гг.Средний возраст пациентов группы ГМ составил 52 ± 3,5 года (29-82),из них было 14 (52%) мужчин и 13 (48%) женщин (соотношение 1,1:1)(Таблица 7).
По стадиям заболевания больных распределили следующимобразом: IA – 3 (11%), IB - 9 (33%), IIA - 6 (22%), IIB - 5 (19%), IIIA - 3 (11%),IVA2 - 1 (4%). Стадирование ГМ осуществлялось согласно классификацииTNM (tumor-node-metastasis) (ПРИЛОЖЕНИЕ А). Пациенты с классическойформой ГМ были подразделены на три подгруппы согласно клиническимстадиям заболевания: пятнистая - 11 (41%), бляшечная - 8 (30%), опухолевая- 5 (18%) (Рисунок 3). Также в исследование были включены пациенты сэритродермическойклинико-морфологическойформой–2(7%)ифолликулотропным подтипом ГМ – 1 (4%).Средний возраст больных БП составил 52 ± 2,5 лет (от 28 до 68), изних было 10 (44%) мужчин и 13 (56%) женщин (соотношение 1:1,3) (Рисунок4).
В группу БП были включены пациенты со следующими диагнозами: МБП- 9 (39%) пациентов, КБП - 14 (61%).45Группа контроля включала 10 здоровых лиц (средний возраст 44 ± 2,5лет) (Таблица 7). Эти лица не предъявляли жалоб на момент обследования,болели респираторными заболеваниями не более двух раз в год, не имелиявных хронических очагов инфекции, признаков аллергии и другойпатологии.Таблица 7 – Общая характеристика исследуемых группВозраст, лет КоличествоПолM±mпациентовМужскойЖенскийГМ52 ± 3,52714 (52%)13 (47%)КБП53 ± 2,5146 (43%)8 (57%)МБП49 ± 2,594 (44%)5 (56%)ЗД44 ± 2,5106 (60%)4 (40%)Примечание.
ГМ – больные грибовидным микозом; КБП – больные крупнобляшечнымпарапсориазом; МБП – больные мелкобляшечным парапсориазом; ЗД – здоровые лица.21%46%1 - пятнистая2 - бляшечная33%3 - опухолеваяРисунок 3 – Распределение исследуемых больных классической формойгрибовидного микоза по клиническим стадиям46161412108М6Ж420ГМКБПМБПЗДРисунок 4 – Распределение исследуемых групп по полу. ГМ – больныегрибовидным микозом; КБП – больные крупнобляшечным парапсориазом;МБП – больные мелкобляшечным парапсориазом; ЗД – здоровые лица2.2.
Критерии включения, невключения и исключения из исследованияКритериями включения пациентов в исследование являлись:Установленный диагноз ГМ (с наличием любой клиническойформы и стадии независимо от тяжести заболевания) или БП.Возраст пациента от 18 лет.Добровольноежеланиеучаствоватьиподписанныеинформированное согласие с общим планом обследования и лечения, а такжена диагностическую процедуру (биопсию) и проведение генетическогоисследования.Критерии невключения:Несоответствие критериям включения.Нежелание пациента участвовать в исследовании.Наличие сопутствующей соматической патологии у пациентов встадии декомпенсации, онкологические заболевания, нарушения функциипечени, алкоголизм, наркомания, психические расстройства.47Беременность, кормление грудью.Критерии исключения:Желание пациента прекратить участие в исследовании.Беременность.Несоблюдениепациентомрежима,назначеннойсхемыобследования и лечения.Регулярныйприемсистемныхкортикостероидовилииммуносупрессантов.2.3.
Методы исследованияВсе пациенты были клинически обследованы согласно Росcийскимклиническимрекомендациямподиагностикеилечениюлимфопролиферативных заболеваний (2016) [40]. Обследование включалоосмотр дерматолога и гематолога, клинический и биохимический анализыкрови, УЗИ органов брюшной полости, малого таза и периферическихлимфатических узлов, рентгенографию органов грудной клетки.
БольнымIIB-IVB стадиями ГМ проводили также компьютерную томографию органовгрудной клетки, брюшной полости и малого таза, трепанобиопсию костногомозга.Диагноз ГМ был верифицирован на основании комплексной оценкиклиническогоосмотра,результатовгистологическогонеоднократного), иммунофенотипического исследований(частобиоптатов изочагов поражения кожи и индекса пролиферативной активности Ki-67, атакже молекулярно-генетического метода с определением клональности пореаранжировке гена γ-цепи ТКР на базе кафедры патологической анатомииПМГМУ им.
И.М. Сеченова и ФГБУ «НМИЦ гематологии».482.3.1. Оценка тяжести кожного поражения с учетом модифицированнойшкалы (modified Severity Weighted Assessment Tool -- mSWAT)Измерялся процент вовлечения площади поверхности всего тела(%TBSA) отдельно для пятен, бляшек и опухолей в 12 областях тела сиспользованием ладони пациента в качестве «критерия». Общий % TBSA дляпоражения каждого типа умножали на взвешенный фактор тяжести (1 =пятно, 2 = бляшка и 4 = опухоль) и суммировали, получая шкалу mSWAT.2.3.2.
Гистологическое исследование биоптатов пораженной кожиИспользовался метод инцизионной биопсии (6 мм). Забор материалапроизводился с использованием инфильтрационной анестезии 2% растворомлидокаина. На кожный дефект накладывалось 2-3 шва, а затем – давящаяповязка. Испытуемые после проведенного гистологического исследованиянаходились под наблюдением в течение 7-10 дней, впоследующемпроводилось снятие швов.
Исследуемый материал помещался в тару,содержащую 10%нейтральный формалин. Затем материал подвергалсястандартной проводке с последующей парафиновой заливкой. Срезытолщиной 4-5 мкм окрашивались гематоксилином-эозином, а такжегематоксилиномипикрофуксиномпоВан-Гизону.Гистологическоеисследование проводилось в проходящем свете с помощью световогомикроскопа Carl Zeiss (Германия) с использованеим объективов 4х, 10х, 20х,40х, 100х, 200х, 400х.2.3.3. ИммунофенотипированиеДляиммуногистохимическогоисследованияиспользовалисьпарафиновые срезы.Гистологические срезы (толщина = 3 мкм), приготовленные намикротоме (MICROM HM-325-2, Germany), помещали на стекла, которыебыли покрыты полизином.
Затем в трех порциях ксилола препаратыдепарафинировали, после чего в течение 3-4 минут промывали в фосфатно-49солевом буфере. В дальнейшем препараты обрабатывались 0,3% перекисьюводорода в течение 20 минут. После промывки в нескольких порцияхфосфатно-солевого буфера (ФСБ) на срезы наносили первичные антитела сдальнейшей инкубацией при температуре 37оС в течение 40-45 минут. Затемпроизводили промывку в ФСБ по 5 минут в каждой из двух порций, после на срезы наносили антивидовой конъюгат DAKO EnVISION+SYSTEM HRP иинкубировали при комнатной температуре в течение 45 минут.
После этогоматериал промывали в двух порциях ФСБ по 5 минут в каждой, а затемобрабатывали 3,3-диаминобензидин-тетрахлоридом в течение 3 минут. Затемсрезы докрашивали гематоксилином. Гранулы темно- и светло-коричневогоцвета в структурах клеток считались продуктом положительной реакции.Также выполнялось окрашивание срезов без использования первичныхантител для отрицательного контроля.При проведении ИГХ исследования использовались первичныеантитела, представленные в таблице 8.Иммуногистохимическоеисследованиекожисизучениемиммунофенотипов CD3+, CD4+, CD5+, CD7+, CD8+, CD45RO+, определениеиндекса пролиферативной активности Ki-67 проводили на парафиновыхсрезах по схемам, рекомендуемым фирмами производителями.
Оценкурезультатов проводили полуколичественным методом с подсчетом числаклеток. Экспрессия исследуемого маркера расценивалась как слабая <<+>>при наличии окрашенных гранул в 1-50-ти клетках, умеренная <<++>> - в 51100 клетках и резко выраженная <<+++>>> - в 101 и более клетках, в четырехполях зрения при увеличении х 400.50Таблица 8 - Панель используемых в работе моно- и поликлональных антителНазвание антитела, клон,фирма-производительСпецифичностьCD3(Dako, США)Все зрелые Т-клетки,экспрессируются тимоцитами взависимости от степенидифференцировкиCD4(Novocastro, Великобритания)Субпопуляции тимоцитов, Тлимфоцитов, хелперы/индукторы,моноциты/макрофагиCD5(Dako, США)Ранние тимоциты, зрелые Т-клетки(сильная экспрессия); субпопуляцияВ-клетокCD7Маркер Т-лимфоцитовCD8(Dako, США)Большинство тимоцитов, маркер Тклеток-киллеров, клеткиестественные киллерыCD45ROТ-клетки памятиKi-67(Dako, США)Экспрессия клетками в поздней G1,S, G2, M-фазах клеточного цикла,отсутствует в Go-фазе2.3.4.
Определение реаранжировки по генам γ-цепи Т-клеточного рецептораОценку T-клеточной клональности проводили на основании изученияреаранжировки генов TCRG (V-J) и TCRB (V-J, D-J) с использованиемметода ПЦР с мультиплексными системами праймеров BIOMED-2. Длявыделения ДНК из ткани, залитой в парафиновый блок, использовали 5срезов по 5 мкм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
