Диссертация (1140658), страница 5
Текст из файла (страница 5)
clusters of differentiation – кластеры дифференцировки)[53, 55]. С помощью моноклональных антител проводится идентификацияантигенов, подтверждающих принадлежность лимфоцитов к определеннойпопуляции,субпопуляции,атакжехарактеризующихуровеньихдифференцировки [68, 70].Иммунофенотипически при ГМ можно выявить патологическуюпопуляцию Т-клеток, если опухолевые Т-клетки имеют аберрантныйфенотип, т.е. утрату одного или нескольких из общих Т-клеточных маркеров,а также в случаях, когда фенотип опухолевых Т-клеток соответствуетранним, внутритимическим стадиям дифференцировки [48, 50].29При ИФТ биоптатов кожи у больных с БП и ГМ выявлено, что основуинфильтрата составляют СD4+ клетки, а увеличение показателя соотношенияCD4/CD8 рассматривается как значимый маркер в диагностике ГМ [13, 93].Согласно алгоритму диагностики ранних форм ГМ, предложенномуМеждународным обществом по лимфомам кожи (ISCL), различаютследующие иммуногистохимические признаки [136]:1.
Количество CD2+, CD3+, и/или CD5+ Т-клеток < 50%.2. Количество CD7+ Т-клеток < 10%.3. Эпидермально/дермальное несоответствие экспрессии CD2, CD3, CD5и CD7 (дефицит экспрессии в эпидермисе).ПоданнымKeehnC.A.исоавт.[98],ГМхарактеризуетсяинфильтратом из α/β Т-хелперов – зрелых клеток памяти, которые имеютследующий иммунофенотип: βF1+ CD3+ CD4+ CD5+ CD7+ CD8- CD45RO+.Реже встречаются Т-цитотоксический (βF1+ CD3+ CD4- CD5+ CD8+) и γ/δ(βF1- CD3+ CD4- CD5+ CD8+) фенотипы. В поздних стадиях ГМ можетнаблюдаться полная или частичная потеря экспрессии пан-Т-клеточныхантигенов CD3, CD5 и CD7, появление экспрессии цитотоксическихпротеинов TIA-1, гранзима В и перфорина, а также аберрантный CD4+/CD8+или CD4-/CD8- фенотип [3, 98].При ГМ, несмотря на его медленное развитие, также происходитнарушение нормального цикла деления клеток, следствием чего являетсяклональнаяпролиферацияТ-лимфоцитов.Дляустановленияуровняпролиферативной активности клеток с помощью иммуногистохимическогоисследования используется протеин Ki-67.
Согласно данным Жукова А.С.[35], индекс пролиферативной активности клеток у больных ГМ бляшечноопухолевой стадии выше, чем у больных БП.Ряд авторов рекомендует учитывать в диагностике ГМ и другиемаркеры. В частности, С. Bernier et al. предлагают использовать CD13 [67], аDi Trolio et al.
[81] - Heca-452 (СLA – антиген лимфоцитов, ассоциированных30с кожей),Жуков и соавт. - Langerin/CD207 [35], Сыдиков и соавт. -CD209/DC-Sign [54].Стоит отметить, что уровень экспрессии антигенов в лимфоидноминфильтратезависитотвидаизучаемогоантигенаиметодаегоисследования. По данным Е.В. Братцевой и С.В. Ротанова [4] в настоящеевремя при ИФТ является рутинным определение экспрессии антигенов CD2,CD3 и CD5. Снижение экспрессии этих маркеров на Т-клетках более чем на50% является признаком ТКЛК с чувствительностью 100%, однако в случаедиагностики ГМ чувствительность метода снижается до 10%. Это положениетакже справедливо относительно дермоэпидермальной дискордантностирезультатов исследований CD2, CD3 , CD5 и CD7 [3, 4].1.2.4.
Молекулярно-генетический метод определения реаранжировки генаТ-клеточного рецептораДанный метод диагностики существенно облегчил процесс постановкидиагноза ГМ. Благодаря Southern E.M. он используется с 1975 г. (метод блотгибридизации по Саузерну) [150].Молекулярно-генетическоеисследованиепозволяетобнаружитьнарушения перестройки цепи ТКР лимфоцитов не только в коже, но и впериферической крови.Появление клона Т-лимфоцитов при опухолисопровождается появлением популяции клеток с одинаковой перестройкойгенов ТКР (моноклональность ТКР) [56].Т-клеточный рецептор (ТКР, TCR) – гетеродимер, состоящий из двухтипов цепей. Более 90% от всех Т-клеток экспрессируют αβ-TCR и примерно5% – γ/δ-TCR [35, 39, 49, 50, 57, 122].Т-клеточная клональность традиционно оценивается с помощью двухметодов - Саузерн-блоттинга и полимеразной цепной реакции (ПЦР).Саузерн-блоттинг — трудоемкий метод, требующий большого количествагеномной ДНК высокого качества и радиоактивной метки, в связи с чемредко применяется для рутинной диагностики.
Наибольшее распространение31для оценки Т-клеточной клональности с начала 90-х годов получила именноПЦР,котораяширокоиспользуетсявклиническойпрактике[50].Ей свойственна техническая простота и быстрота выполнения [78].Однако, наличие клональности по генам γ-цепи ТКР не обязательноозначает наличие опухоли.Популяция клональных Т-лимфоцитов может выявляться не только приразвитии ГМ, но и при доброкачественных воспалительных «клональных»дерматозах: парапсориазе Муха–Габермана, экземе, псориазе, красномплоском лишае и некоторых псевдолимфомах [131], поэтому обнаружение Тклеточной клональности не должно рассматриваться как абсолютныйкритерий верификации диагноза ГМ. Также на ранних стадиях ГМ возможенложноотрицательный результат ввиду недостаточности опухолевых клетокдля амплификации гена ТКР [49].ПЦР-диагностикадляидентификацииреаранжировкигенаТ-клеточного рецептора является специфичной (86-95%), но недостаточночувствительной (52%).
В связи с этим моноклональность Т-лимфоцитовинфильтрата является стабильным признаком только в опухолевой стадииГМ [33, 35, 66].По данным Bernier C. вероятность установления диагноза ГМмолекулярно-биологическим методом на поздних стадиях (IIВ-IV) составляет90%, на ранних (I-IIA) - 50% [67].Таким образом, основополагающим в диагностике ГМ являютсядинамическоенаблюдениеклиническихпроявленийзаболевания,неоднократные гистологические и иммуногистохимические исследования всочетании с молекулярно-генетическим анализом.В настоящее время использование молекулярно-генетических методовдля диагностики ГМ активно развивается, однако до сих пор единственнымприменяемым методом является определение реаранжировки гена ТКР, чтообуславливаетнеобходимостьпоискановых,генетических маркеров для ранней диагностики ГМ.болееинформативных321.2.4.1.Молекулярно-генетическиемеханизмыдиагностические маркеры грибовидного микозапатогенезаиМолекулярно-генетические исследования, проведенные в последниегоды, убедительно доказывают роль генетических факторов в инициациизлокачественного процесса и развития опухоли [16].При исследовании кожи больных ТКЛК с помощью ДНК-микрочиповустановлено, что увеличение уровня экспрессии ядерного фактора ТОХ,необходимого для развития CD4+ Т-клеток в тимусе, и микро-РНК-326, -663,-711, а также снижение уровня экспрессии микро-РНК-203, -205 посравнению со здоровыми лицами и больными с хроническими дерматозамисвидетельствует о лимфопролиферативном процессе [138, 167].Так, у больных ГМ определено снижение RB1 и повышение уровняэкспрессии циклина D1, оказывающие воздействие на клеточный цикл [119],а также наблюдаются изменения на хромосомах 10q и 17p [118].По данным О.И.
Зайцевой [15], аномальное метилирование генов p21,RASSF, p16, CDH1, N33, CD44 характерно для IIА и III стадий ГМ. Убольных I стадией ГМ, атопическим дерматитом и псориазом, здоровых лицаномального метилирования генов не выявлено.Установлено, что экспрессия онкогенов p16 и p53 меняется припрогрессировании ГМ, но не изменяется на ранних стадиях заболевания[128]. В нескольких исследованиях были обнаружены мутации гена FAS инарушения экспрессии генов JUNB и JUND у больных ГМ [79, 120].Тем не менее, патогенетические механизмы развития ГМ так иостаются не до конца установленными.
По данным Berger C.L. [65], впоследнее время все большее значение придается микроокружениюмалигнизированных лимфоцитов. Считается, что клетки, окружающиеопухоль, могут оказывать влияние на инициацию или течение опухолевогопроцесса[65].Кмикроокружению малигнизированныхлимфоцитовотносятся Т-регуляторные клетки, которые являются специализированнойсубпопуляциейТ-лимфоцитов,обладающиеиммуносупрессивными33свойствами. Они поддерживают гомеостаз иммунной системы, подавляяизбыточную активность эффекторных Т-клеток в реакциях с чужероднымиантигенами.ИзбыточнаяактивностьТ-регуляторныхклетокчастонаблюдается при злокачественных новообразованиях [14].Т-регуляторные клетки (Т-рег) экспрессируют транскрипционныйфакторFOXP3(ForkheadBoxProtein),важныйдляподдержанияиммунологической толерантности [106].Немаловажное значение имеет цитокиновый профиль, который убольных ГМ различается в зависимости от стадии заболевания.
Если в началеразвития ГМ преобладает экспрессия Th1-цитокинов, интерферона (IFN)γ,TNF-α и интерлейкинов (IL-2, IL-12), то в прогрессирующих стадияхпроисходит «сдвиг» к Th2-профилю (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13) [13]. IL-12 -мощный противоопухолевый цитокин, основными эффектами которогоявляются увеличение продукции IFN-γ, а также стимуляция роста ицитотоксичности активированных NK-клеток, CD8+ и CD4+ Т-клеток,смещение дифференцировки CD4+ Th0-клеток в сторону Th1-фенотипа [111].Также установлено, что STAT-сигнальная система играет центральнуюроль в процессе канцерогенеза [129].
STATs (signal transducers and activatorsof transcription — сигнальные передатчики и активаторы транскрипции) —семейство из шести транскрибируемых факторов, которые фосфорилируютсяодной из четырех рецептор-связанных Янус-киназ (Janus kinases — JAKs)вследствие цитокиновой стимуляции (Рисунок 1).Значимостьбелковданногосемействавиммунныхреакцияхобусловлена их ядерным расположением, что обеспечивает возможностьнапрямую регулировать множество генов-мишеней в патогенезе ГМ [10,149].34Рисунок 1 - STAT-передача импульсов в лимфоцитах у больных грибовидныммикозом [Netchiporouk, Жуков иммун] (адаптирован)На ранних стадиях заболевания повышенный уровень экспрессииIL2RA, IL-2, IL-7, IL-15 способствует активации STAT5, который,фосфорилируясь, проникает в ядро и регулирует экспрессию генов апоптоза(например, Bcl-2, Bcl-x), генов клеточного цикла (Cyclin-D, c-Myc), Th-2цитокинов (IL-4) и микро-РНК-155.
Микро-РНК-155 служит "мостом междувоспалением и раком”, т.к. увеличивает геномную нестабильность истимулирует процесс пролиферации опухолевых клеток [129, 154]. Поданным Litvinov et al, одной из важнейших функций микро-РНК-155 являетсярегуляция экспрессии STAT4, в то же время уровень экспрессии IL-12снижается, теряется экспрессия β2-цепи рецептора IL-12 в злокачественныхТ-лимфоцитах [114, 129]. По данным R. Nishikomori [133] экспрессия STAT4играет ключевую роль в процессе дифференцировки Th1 вследствие35цитокиновой стимуляции (IL-12), а также в последующем переходе от Th1- кTh2-фенотипу ГМ [115].На поздних стадиях грибовидного микоза повышенная активацияSTAT5 и STAT3, которые фосфорилируются JAK1 и JAK3, может статьполностью цитокин-зависимой (IL-21) [105, 114].В последние десять лет метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) всешире используется в медицинской генетике и онкологии.
Это связано свозможностьюточногоопределенияисходногоколичествамолекулматричной РНК и генотипированием в формате мультиплексной ПЦР свысокой чувствительностью. Эти особенности ПЦР-РВ позволяют успешноприменять метод там, где ранее обычный ПЦР-анализ не мог датьдиагностически значимой информации [38].Кроме того, ПЦР-РВ позволяет с высокой достоверностью определятьразличия в экспрессии генов в 20-30%, имея при этом более низкийкоэффициент вариации, чем методы с детекцией результатов «по конечнойточке». С помощью ПЦР-РВ, в отличие от обычной ПЦР, гораздо прощеотдельно регистрировать мРНК с почти идентичными последовательностями.[16].Согласно рекомендациям Международного общества по лимфомамкожи (ISCL), Европейской организации изучения и лечения рака (EORTC)[136] и вышеизложенным данным поиск и изучение генетических маркеровдля ранней диагностики ГМ по-прежнему остается актуальной проблемой всовременной дерматоонкологии.1.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
