Диссертация (1140107), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Критериями включения пациентов в экспериментальную группупослужили:1) Возраст от 18 до 88 лет;2) Документально подтверждённый диагноз болезнь Паркинсона, выставленный всоответствие с международными клинико-диагностическими критериями Банкаголовного мозга общества болезни Паркинсона Великобритании;3) Наличие подписанной формы информированного согласия на участие в данномисследовании.Критерии исключения из исследования:1) Отсутствие информированного согласия;2) Женщины в состоянии беременности и лактации;3) Наличие любого онкологического заболевания;4) Больные с тяжелой сопутствующей патологией в стадии декомпенсации,которая, по мнению исследователя, может повлиять на результаты исследования;5) Неспособность пациента следовать устным и письменным инструкциям;6) Наличие симптомов острого кишечного расстройства на момент визита;7) Курсы антибактериальной терапии любой длительности в течение последних 4недель до момента включения;9) Отказ пациента от участия в исследовании;10) Наличие любого иного дегенеративного либо воспалительного заболеваниянервной системы.Медиана возраста пациентов в контрольной группе составила 52 [40; 62]37года.Критериями включения пациентов в контрольную группу послужили:1) Возраст от 18 до 88 лет;2) Отсутствие у пациентов любых нейродегенеративных и воспалительныхзаболеваний нервной системы;3) Наличие подписанной формы информированного согласия на участие в данномисследовании.Критерии исключения из исследования:1) Отсутствие информированного согласия;2) Женщины в состоянии беременности и лактации;3) Наличие любого онкологического заболевания;4) Больные с тяжелой сопутствующей патологией в стадии декомпенсации,которая, по мнению исследователя, может повлиять на результаты исследования;5) Неспособность пациента следовать устным и письменным инструкциям;6) Наличие симптомов острого кишечного расстройства на момент визита;7) Курсы антибактериальной терапии любой длительности в течение последних 4недель до момента включения;9) Отказ пациента от участия в исследовании.В группу сравнения вошли пациенты со следующими заболеваниями:рассеянный склероз — 15 пациентов, эссенциальный тремор — 10 пациентов,идиопатическая семейная дистония — 5 пациентов, а также по одному пациенту сдиагнозами множественная системная атрофия, деменция с тельцами Леви иострый рассеянный энцефаломиелит.
Медиана возраста пациентов в группесравнения составила 58 [38; 66] лет. Критериями включения пациентов в группусравнения послужили:1) Возраст от 18 до 88 лет;2) Наличие любого дегенеративного либо воспалительного заболевания нервнойсистемы, за исключением болезни Паркинсона;3) Наличие подписанной формы информированного согласия на участие в данномисследовании.38Критерии исключения из исследования:1) Отсутствие информированного согласия;2) Женщины в состоянии беременности и лактации;3) Наличие любого онкологического заболевания;4) Больные с тяжелой сопутствующей патологией в стадии декомпенсации,которая, по мнению исследователя, может повлиять на результаты исследования;5) Неспособность пациента следовать устным и письменным инструкциям;6) Наличие симптомов острого кишечного расстройства на момент визита;7) Курсы антибактериальной терапии любой длительности в течение последних 4недель до момента включения;9) Отказ пациента от участия в исследовании.Всем пациентам проводилось клиническое обследование и неврологическийосмотр.
У каждого пациента был собран биоматериал — кал. Биоматериалзамораживался до -20 С и в течение двух часов доставлялся в лабораторию, гдехранился до востребования при температуре -80 С.Ввиду наличия различий между группами пациентов по возрасту,проводиласьоценкаобщеговкладавозраставвариабельностьсоставамикробиома кишечника при помощи непараметрического дисперсионногоанализа.
Отмечено, что возраст вносит вклад в вариабельность состава кишечноймикробиоты (R2 = 0,02; p = 0,01), поэтому при проведении статистических тестоввозраст включался в качестве ковариаты.2.2 Методы исследования.2.2.1 Молекулярно-биологические методы.В данной работе использовались такие молекулярно-генетические методыкак выделение тотальной бактериальной ДНК и ампликонное секвенирование помаркерному фрагменту V3-V4 бактериального гена 16S рРНК.2.2.1.1 Выделение тотальной бактериальной ДНК.Основной трудностью при выделении метагеномной ДНК является39обеспечение полноценного разрушения бактериальных клеток, содержащихся всубстрате.
Для успешного лизирования бактерий была использована методика,заключающаясявтемпературнойимеханическойобработкепробвмногокомпонентном лизирующем буфере, разрушающим клеточные мембраны икомплексы нуклеиновых кислот с белками, с последующим спиртовымосаждением ДНК в присутствии хаотропных солей.Для этого к каждому образцу фекалий добавляли два типа бусин silica-zir(BioSpec Products, США) диаметром 0,1 мм и 0,5 мм, а также лизирующий буфер(500 mM NaCl, 500 mM TrisHCl pH=8, 50 mM EDTA, 4% SDS). Полученную смесьвортексировали до однородного состояния, а затем гомогенизировали в течение3х минут с помощью бисерной мельницы miniBeadBeater (BioSpec Products,США).
Затем гомогенат инкубировали при 70 градусах в течение 15 минут, азатем центрифугировали при 14000 rpm 20 минут. После центрифугированиясупернатант отбирали в новую пробирку. К полученному осадку добавлялилизирующий буфер и вортексировали осадок до однородного состояния, послечего его повторно гомогенизировали с помощью бисерной мельницы в течение 3хминут. Гомогенат также инкубировали при 70 градусах в течение 15 минут, азатем центрифугировали при 14000 rpm 15 минут. После центрифугированиясупернатант отбирали в новую пробирку.
К двум полученным фракциямотобранного супернатанта добавляли 2 объема 96%-ого этанола и 1/10 объемаацетата натрия 3М, после чего полученную смесь инкубировали при -20 градусахне менее 1 часа. Затем проводили двойную отмывку осадка 80%-ым этанолом.Осадок высушивали при комнатной температуре в течение 40 минут. Осадок,полученный из каждого образца ресуспендировали в 400 мкл ТЕ-буфера, послечего образцы инкубировали при 37 градусах в течение 30 минут.
Далее проводилицентрифугирование образцов при 14 000 rpm 15 минут, супернатант отбирали вновую пробирку. К каждому образцу добавляли 1 мкл РНКазы (5 мг/мкл) иинкубировали с ней при 37 градусах в течение 1 часа. Далее образцы ДНКнаправляли на секвенирование.402.2.1.2 Ампликонное секвенирование микробиоты.Ампликонное секвенирование микробиоты по маркерному фрагменту V3V4 гена бактериальной 16S рРНК осуществляли согласно протоколу 16SMetagenomicSequencingLibraryPreparation(Part#15044223Rev.B),рекомендованному Illumina для секвенатора MiSeq.Образцы тотальной бактериальной ДНК, ранее выделенной из биоматериалапациентов, разводили в 500 раз.
Первый раунд амплификации вариабельныхучастков V3-V4 гена 16S рРНК осуществляли с использованием специфическихпраймеров:1)TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG2)GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCCна амплификаторе DNA Engine Tetrad® 2, Bio Rad по следующей программе:95°C 3 минуты25 циклов: 95°C 30 секунд55°C 30 секунд72°C 30 секунд72°C 5 минутОхлаждение 4°CОчистка полученных ПЦР-продуктов проводилась с использованием бусинAgencourt AMPure XP (Beckman Coulter) в соответствии с протоколом,рекомендованным производителем.Второй раунд амплификации для двойного индексирования образцовосуществляли с использованием двух комбинаций специфических праймеров, последующей программе:95°C 3 минуты8 циклов:95°C 30 секунд55°C 30 секунд72°C 30 секунд72°C 5 минутОхлаждение 4°C41Очистка полученных ПЦР-продуктов также проводилась с использованиембусин Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) в соответствии с протоколом,рекомендованным производителем.Концентрацию полученных библиотек ампликонов фрагмента V3-V4 генабактериальной 16S рРНК определяли при помощи набора Quant-iT™ dsDNAHigh-Sensitivity Assay Kit на флуориметре Qubit® (Invitrogen, США) Очищенныеампликонысмешивалиэквимолярновсоответствиисполученнымиконцентрациями.
Качество приготовленной для сиквенса библиотеки оценивалина приборе Bioanalyzer 2100 (Agilent) с использованием набора Agilent DNA 1000Kit.Дальнейшая подготовка образца к секвенированию и секвенированиеобразца осуществляли с использованием набора MiSeq Reagent Kit v2 (300циклов)иприбораMiSeq(Illumina,США)согласнорекомендациямпроизводителя.2.2.2 Биоинформатические методы: Таксономический анализ микробиотыТаксономическийанализпрочтенийсеквенатораосуществлялсясиспользованием программного обеспечения QIIME 1.9.1 (J.G.Caporaso et al,2010). В анализ брались прямые прочтения с прибора. На первом этапе прочтенияв формате .fastq перекодировались в отдельные файлы в формате .fna,содержащие информацию о понуклеотидной последовательности прочтения, и.qual, содержащие информацию о качестве каждой буквы в прочтении в видебаллов Phred (P.Richterich, 1998).
Далее полученные файлы прочтенийфильтровались по качеству: удалялись буквы с баллом Phred менее 19 (точностьопределения нуклеотида 99% и более). Все прочтения с итоговой длинной менее120 пар оснований в анализ не включали.Дляопределениятаксономическогоположенияпрочтенийбылаиспользована стратегия, заключающаяся в сравнении прочтений с наборомреференсных (шаблонных) последовательностей. В качестве референсной базыданных использовалась база GreenGenes версии 13.5 (T.Z.DeSantis et al, 2006).42Непосредственно подбор прочтений осуществлялся с использованием алгоритмаuclust_ref (R.C.Edgar, 2010). Принцип действия данного алгоритма заключается всоздании кластеров из прочтений на основе структурного сходства (сходствапонуклеотидного состава) с последовательностями, приведенными в базе данныхGreenGenes. Затем из всех прочтений выбирается одна последовательность —представитель класса.
В данном случае в качестве представителя класса выбиралинаиболее частое прочтение из кластера. Из представителей класса составлялиперечень прочтений, при этом, в перечне за количество прочтений данногопредставителя принималось число прочтений, входящих в данный кластер.Наследующемэтапеосуществлялиопределениетаксономическогоположения для выбранного перечня прочтений, то есть определяли каждому изпрочтенийсоответствующуюоперационнуютаксономическуюединицу,описывающую его принадлежность на максимально возможную глубину, отцарства вплоть до вида.
Для этого использовался алгоритм RDP classifier, в основекоторого лежит использование наивного байесовского классификатора и две базыданных GreenGenes и HITdb (Q.Wang et al, 2007; J.Ritari et al, 2015). Результат,полученный с использованием GreenGenes, использовался для статистическойобработки и при поиске таксономических различий, поскольку данная базаявляется стандартной и позволяет проводить сравнение результатов междуразличными исследованиями. База данных HITdb применялась с целью полученияметагеномных профилей микробиоты для машинного обучения, так как давалалучшеекачествотаксономическогопредсказательныхположениямоделей.прочтенийПослеметагеномныеопределенияпрофилиперекодировались в формат .biom для дальнейшей работы (D.McDonald et al,2012).2.2.3 Статистические методы.2.2.3.1 Расчет индексов таксономического разнообразия.Расчет индексов разнообразия проводился с использованием программногообеспечения QIIME 1.9.1.43Для расчета α-разнообразия на первом этапе устраняли погрешность,связаннуюснеравномерностьюглубинысеквенированияприпомощипрореживания образцов до уровня образца с наименьшим допустимымколичеством операционных таксономических единиц.
Прореживание заключаетсяв случайном отборе операционных таксономических единиц бактерий из данногообразца до того момента, пока их количество не достигнет выбранного порога.После прореживания рассчитывались кривые α-разнообразия. Для расчётакривыхиз каждогообразца бралисьдесятьслучайныхподвыбороксвозрастающим количеством операционных таксономических единиц. Для каждойподвыборки рассчитывали индексы α-разнообразия Шеннона, observed otus и PDwhole tree, средние значения индексов отмечали на графике и соединяли прямымилиниями.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
