Диссертация (1140107), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Кроме того, значимым преимуществомявляется стандартизация результата, которая дает возможность сравнениярезультатов исследований, выполненных различными коллективами при условиииспользованияодинаковойреференснойбазыисходногопротоколаэксперимента. При этом, данный метод плохо применим для исследованиямалоизученных бактериальных сообществ.При использовании подхода de novo прочтения агрегируют в кластеры наосновании сходства по нуклеотидной структуре между собой (J.Guo et al, 2016).Порог сходства прочтений, как и в случае референсного подхода, составляет 97процентов. Затем для каждого кластера определяется последовательностьпредставитель,котораяиспользуетсядляопределениятаксономическогоположения данной ОТЕ. Классификация de novo позволяет использоватьразличные базы данных, не только генов 16S рРНК, а также находить новые,потенциально неизученные виды микроорганизмов.
При этом классификация denovo намного более требовательна к вычислительным ресурсам и плохо подходит14для получения стандартизированного результата.Смешанный подходзаключаетсяв поочередном применении двухпредыдущих методик (J.G.Caporaso et al, 2010). На начальном этапе производитсяопределение таксономического положения всех прочтений с использованиемреференсного подхода. Затем, для прочтений, не обнаруживших необходимойстепени сходства с референсной базой, проводится поиск de novo. Таким образом,затраты на вычисления несколько снижаются, однако сохраняются трудностисвязанные с сопоставлением результатов различных исследований.Ампликонноесеквенированиемикробиотыдаетинформациюпреимущественно о таксономическом составе микробиоты в изучаемом образце.К его достоинствам относят дешевизну проведения, производительность,сравнительную простоту обработки и анализа результата.
Однако, данный подходне дает прямой информации о функциональном составе изучаемого сообщества,хотя при помощи некоторых методов на основе такого рода данных можнопроводить реконструкцию метаболического потенциала микробиоты in silico(M.G.I.Langille et al, 2013).Наряду с ампликонным секвенированием для изучения состава микробиотыприменяется и «полногеномное» секвенирование, называемое также shot-gunсеквенированием (с англ., секвенирование методом «дробовика»). В ходе негопроводится химическое либо физическое разделение тотальной ДНК сообществана перекрывающиеся фрагменты небольшой длины, которые затем секвенируют(T.G.Sharpton, 2014).
Просеквенированные фрагменты бактериальной ДНК затемподвергают сборке — процессу восстановления последовательности из пулаперекрывающихсяпрочтений(Afiahayatietal,2015).Полногеномноесеквенирование — дорогостоящая и технически сложная методика, высокиетребования предъявляются как к сбору материала, так и к проведениюсеквенирования и обсчету.
Однако, только данный подход позволяет оценить нетолькотаксономический,сообщества,включаяноифункциональныйегосоставметаболическуюметагеномногоактивность,антибиотикерозистентность, синтез факторов патогенности и т. п. (K.Yarygin et al,152017). Другими вариантами оценки функциональной активности микробиотыкультурнезависимыми методиками являются масс-спектрометрический поискметаболитов,исследованиеметапротеомаиметатранскриптома.Масс-спектрометрия метагеномных сообществ чаще всего используется в качестведополнительного метода исследования, позволяющего оценить активностьметаболизма сообщества (О.Г.Жиленкова и др., 2016; F.Fouhy et al, 2017).Метапротеомика и метатранскриптомика также дает информацию о реализациигенетической информации микробиома, но отличаются еще более высокойсложностью выполнения эксперимента и анализа данных (M.Reck et al, 2015;X.Zhang et al, 2017).
По этим причинам для оценки таксономического составамикробиоты рациональнее всего применять ампликонное секвенирование.Кроме оценки таксономического состава того или иного микробиома в ходеисследования оценивается и его разнообразие. Мерой таксономического богатстваизучаемого сообщества является индекс α-разнообразия — количество различныхвидов в одном образце стандартизированного размера (R.H.Whittaker, 1972).Высокое таксономическое богатство сообщества говорит о его стабильности —отсутствии конкуренции организмов за экологические ниши, поскольку в такомслучае эволюционный успех достигается не за счёт «борьбы» с другимиорганизмаминаселяющимисообщество,априпомощипоискановыхэкологических ниш в среде обитания, что в свою очередь, и ведет к увеличениювидового богатства биоты до определенного предела, задаваемого условиямисреды обитания (J.Wang et al, 2017).
С ухудшением внешних условий, важных длямикроорганизмов, разнообразие также снижается (J.Wang et al, 2017).Аналогом внешней среды для микробиоты человека является организм,тогда как внешними условиями его состояние: активность иммунной системы,характер питания, прием лекарственных средств, наличие заболеваний и т. д. Приэтом отмечается, что при наличии заболеваний, в частности связанных спротеканием воспалительных процессов, разнообразие микробиоты пораженногооргана снижается (M.Craven et al, 2012).
При неблагоприятных условиях обитанияв организме хозяина выживают наиболее универсальные виды микробов,16способные, в том числе, и к активному противодействию иммунной агрессииорганизма — зачастую условно-патогенные патогенные бактерии или штаммы сповышенной резистентностью к антибиотикам (C.Alauzet et al, 2010; W.van Schaik,2015).Поэтойпричинеα-разнообразиемикробиотыявляетсяважнойхарактеристикой, как ее состояния, так и состояния организма хозяина.
Передрасчётом α-разнообразия данные о составе микробиоты прореживаются: изкаждого образца отбирается одинаковое число случайных ОТЕ, что даетстандартизацию размера образца. Для расчёта α-разнообразия используют набориндексов, среди которых наиболее часто используются следующие: индексШеннона (C.E.Shannon, 1948), индекс Симпсона (E.H.Simpson, 1949), индекс Чао(A.Chao, 1984) и Фэйта (D.P.Faith, 1992a; D.P.Faith, 1992b).Кроме расчёта таксономического богатства в одном взятом образце (илигруппе образцов, объединенных по какому-либо признаку) также вычисляется иβ-разнообразие — мера попарного различия между двумя микробиомами(R.H.Whittaker, 1972).
Β-разнообразие показывает, насколько сильно одинмикробиом отличается от другого (или одна группа микробиомов от другой) посовокупному видовому составу. На настоящий момент для расчёта такой мерыразнообразия образцы «размещают» в многомерное пространство, где осикоординат представляют собой ту или иную ОТЕ, а координаты на осях —количества ОТЕ в данном образце (C.Ricotta and S.Burrascano, 2008). Полученнуюматрицу затем обрабатывают различными способами для снижения размерности.Среди них: анализ главных компонент (K.Pearson, 1901; H.Hotelling, 1933), анализглавных координат или классическое многомерное шкалирование, а такженеметрическое многомерное шкалирование (I.Borg and P.Groenen, 2005).
Дляопределениярасстояниймеждуобразцамивпространственеобходимоопределиться с его метрикой: она должна отражать реальную взаимосвязь междуобъектами. В случае метагеномных исследований, оптимальной метрикойявляется UniFrac (от англ. unique fraction - уникальная доля) (C.A.Lozupone et al,2007). При определении расстояний в этой метрике для пары сообществ строятсяфилогенетические деревья. Затем они соединяются, после чего находят17отношение суммарной длины веток, принадлежащих ровно одному сообществу, кобщей длине веток объединенного дерева. Это позволяет учитывать не толькоколичественные различия в представленности таксонов, но и филогенетическуюдистанцию между сообществами (C.A.Lozupone and R.Knight, 2005).1.2 Микробиота человекаЭволюция многоклеточной жизни на Земле проходила в постоянномприсутствии микроорганизмов: бактерий, археев, вирусов, простейших и грибков.Замиллионылетмеждумногоклеточнымиорганизмамиимикробамиустановились тесные и взаимовыгодные симбиотические взаимоотношения(F.Backhed, 2005).
При этом каждая смена поколений характеризовалась ростомвзаимного приспособления организма организма-хозяина и микроорганизмов(R.M.Brucker and S.R.Bordenstein, 2012). В процессе эволюции отмечаетсяпараллельность изменений в составе микробиоты изменениям в геномемакроорганизма (R.M.Brucker and S.R.Bordenstein, 2012). Данное явленияполучило название филосимбиоз (A.W.Brooks et al, 2016). Природа филосимбиозавероятно заключается в отборе «выгодных» для метаболизма организмамикробов, а также элиминации патогенных и условно патогенных бактерийпосредствомсинтезаспецифическихантимикробныхпептидовииммунологической агрессии (R.M.Stilling et al, 2014).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
