Диссертация (1140107), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Автором дано обобщение результата иего научное обоснование, сформулированы выводы.Структура и объем диссертацииДиссертацияизложенана156страницахмашинописноготекста,иллюстрирована 15 таблицами и 35 рисунками, состоит из введения, обзоралитературы,описанияматериаловиметодовисследования,изложениясобственных результатов, заключения, выводов, библиографического указателя,включающего 304 источника.9ГЛАВА I.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1 Понятие о микробиоте. Современные методы изучения микробных сообществМикроорганизмы являются древнейшей и важнейшей частью биосферынашей планеты. Традиционно, к микроорганизмам относят представителейбактерий, вирусов, археев, простейших, а также некоторые виды грибов,характеризующихсямалымиразмерами.Микробыкрайнеширокораспространены на Земле и населяют все биотопы планеты: атмосферу (A.M.Kleinet al, 2016), поднимаясь вплоть до слоя стратосферы (M.Wainwright et al, 2003);гидросферу, включая глубины Марианской впадины (J.Tarn et al, 2016) иагрессивную среду углекислотных озер гидротермальных источников (F.Inagaki etal, 2016); литосферу (J.Wierzchos et al, 2011), а также биосферу — организмыживых существ.
Совокупная биомасса всех микроорганизмов составляет до 90%от общего количество живого на планете, превышая биомассу остальных живыхсуществ в 9 раз (Jawetz, Melnick and Adelberg, 2013). Наибольший интерес вданном случае представляют бактерии и археи.Бактерии не существуют отдельно друг от друга, напротив, они образуютсложную метаболическую кооперацию, совместно поглощая и обрабатываяпитательные вещества из окружающей среды (J.Rousk et al, 2014; J.M.Chaparro etal, 2011).
Такие кооперации также позволяют бактериям выживать в сложныхэкологических условиях и защищать свою экологическую нишу от вторжениянежелательных микроорганизмов за счет системы межбактериального «общения»— quorum sensing (дистанционные микроб-микробные взаимодействия) (W.L.Ngand B.L.Bassler, 2009; S.T.Rutherford and B.L.Bassler, 2012). Для данныхустойчивых межмикробных коопераций Джошуа Ледербергом был предложентермин микробиота (микробиом) — совокупность микроорганизмов (бактерий,археев, вирусов, простейших и микроскопических грибов), проживающихсовместно в одинаковых условиях (J.Lederberg and A.T.McCray, 2001).Некоторые исследователи разделяют термины микробиота и микробиом,определяямикробиомкаксовокупностьвсехгеновмикробиотического10сообщества (R.E.Ley et al, 2006).
Однако, такое определение не совсем корректно,поскольку существует отдельный термин описывающий совокупность генов всегосложного бактериального сообщества — метагеном. Термины метагеном иметагеномика были предложены Хандельсманом с соавторами в 1998 году(J.Handelsman et al, 1998). По аналогии с геномикой — наукой и группойметодических подходов, посвященных изучению геномов отдельных организмов,метагеном представляет собой, исходя из этого определения, совокупный геномвсех организмов, составляющих данную микробиоту, тогда как метагеномика —наука об исследовании совокупного генетического материала, полученногонапрямую из окружающей среды.Исторически, наиболее ранним методом исследования микроорганизмовявляется описательный метод — бактериоскопия. Этот метод, не утерявшийсвоего значения и сейчас, заключается в визуальном изучении формы, строения ихарактера окраски микроба при помощи микроскопа, как с использованиемдифференциальной окраски, так и без нее.
Данный метод заложил необходимуюбазу для таксономической классификации и идентификации микроорганизмов.Однако он имеет достаточно серьезные ограничения — при бактериоскопииневозможно идентифицировать многие морфологически схожие виды бактерий, атакже сделать заключение о характере метаболической активности. Ввиду этого,допоявлениякультуральныхметодикиподходовпоопределениюметаболической активности микробов в науке присутствовала гипотеза омикробном плеоморфизме — отсутствии в систематике бактерий четкоочерченного понятия «вид».
Развитие культуральных методов, появлениеэлективных сред и биологических моделей для выделения и выращиваниямикроорганизмов позволило более подробно изучить физиологические ибиохимические аспекты их жизнедеятельности, в том числе и определитьвозбудителей многих инфекционных заболеваний, таких как чума, туберкулез,сибирская язва.Однако,прибактериологическихвсейметодик,эффективностиполноценноебактериоскопическихисследованиеибактериальных11сообществ оказалось весьма затрудненным, поскольку до 90% микроорганизмовкрайне тяжело поддаются культивированию в лабораторных условиях (A.Suau etal, 1999; А.В.Олескин и др., 2016).
Поэтому для изучения сложных имногокомпонентных микробных сообществ во всей совокупности наибольшеераспространение получили молекулярно-биологические методы, основанные напрочтении бактериального генома – всей последовательности либо определенногогена (M.Hamady and R.Knight, 2009).Самымраспространеннымиэффективнымметодомисследованияструктуры генетического кода микробиома является секвенирование новогопоколения (с англ. next-generation sequencing, NGS) – группа различных подходовкпрочтениюпонуклеотидныхпоследовательностейнуклеиновыхкислот(А.А.Кожевников и др., 2017). Основным отличием NGS от классическогосеквенирования по Сэнгеру служит то, что при секвенировании нового поколенияпроисходит одновременное «прочитывание» сразу большого количества молекулнуклеиновых кислот, что позволяет крайне быстро и достаточно дешево получитьподробную информацию о геноме исследуемого организма и/или сообщества(J.P.de Magalhães et al, 2010).
В дальнейшем эта информация может бытьиспользована для установления таксономической композиции исследуемогомикробного сообщества и/или его функциональной активности (N.Hall, 2007). Вметагеномных исследованиях используется два основных подхода к проведениюсеквенирования,различающиесяколичествомихарактеромполучаемойинформации.Первый подход, называемый ампликонным секвенированием, заключается вамплификации и секвенировании определенного фрагмента генома исследуемыхорганизмов.
Выбор фрагмента зависит от цели исследования. В случае оценкитаксономического состава микробных сообществ и отдельных микроорганизмовисторически наиболее ранним являлось исследование структуры бактериальногогена 16S рибосомальной РНК (C.R.Woese and G.E.Fox, 1997; A.Suau et al, 1999).Такой выбор обусловлен некоторыми особенностями данного гена:1. Во-первых, этот ген имеют все бактерии и он критически важен для их12жизнедеятельности – при его потере невозможно образование рибосом, а какследствие и синтез белка, что приведет к гибели бактериальной клетки. Ввидутого, что 16S рРНК напрямую участвует в синтезе белка, ее нуклеотиднаяструктура достаточно стабильна, и многие случайные мутации выдавливаютсяотбором (S.C.Abeysirigunawardena et al, 2017).2.Во-вторых,впоследовательностигенасодержатсякаквысококонсервативные участки, которые кодируют важные компоненты рРНК,участвующие в белковом синтезе, так и вариабельные регионы.
Структуравысококонсервативных регионов отличается высокой степенью сходства междувсеми бактериями (T.Coenye and P.Vandamme, 2003). Между ними расположеныдевять вариабельных регионов (V1-V9). В свою очередь вариабельные регионыотличаются большим разнообразием в нуклеотидном составе, что позволяетиспользовать их для идентификации таксономического положения бактериивплоть до вида (K.Fukuda et al, 2016).3. Тот факт, что вариабельные регионы фланкируются консервативными,позволяет создавать универсальные праймеры на фланкирующие консервативныеобласти гена, подходящие для подавляющего большинства бактерий.
С ихпомощью можно получать ампликоны вариабельных областей гена 16S рРНК,расположенных между консервативными участками, сразу для многих видовбактерий и археев (Z.J.Jay and W.P.Inskeep, 2015).Идентификация таксономического состава осуществляется на основесравнения полученных прочтений с имеющимися базами данных о структурегенов 16S рРНК у различных видов бактерий. Условной единицей подобнойклассификации служит операционная таксономическая единица (ОТЕ), котораяописывает таксономическое положение микроорганизма исходя из нуклеотиднойпоследовательности генов, в данном случае бактериальных генов 16S рРНК, безпроведениябактериоскопическихибактериологическихисследований(T.S.Schmidt et al, 2014). Существует несколько подходов к филогенетическойклассификации прочтений: прямое сравнение с референсной базой ОТЕ,определение прочтений de novo и смешанный подход (J.G.Caporaso et al., 2010).13При использовании референсного подхода к идентификации проводитсяпрямое сравнение прочтений, полученных в ходе секвенирования, с эталоннымипрочтениями, содержащимися в одной из нескольких референсных баз данных.Все эталонные прочтения сопоставлены с ОТЕ бактерий, при этом различныеОТЕ дают неодинаковую глубину классификации: от уровня царства и типа, доуровня рода и вида.
Наиболее распространёнными базами прочтений генов 16SрРНК являются SILVA (C.Quast et al, 2013), GreenGenes (T.Z.DeSantis et al, 2006),RDP (J.R.Cole et al, 2014) и HITdb (J.Ritari et al, 2015). Последовательностькаждого экспериментального прочтения сравнивается с набором эталонных;сохраняются и объединяются в ОТЕ лишь те прочтения, для которых процентсовпадения по нуклеотидному составу с одним из эталонов составляет не менее97. Данный порог обусловлен степенью сходства бактериальных генов 16S рРНКвнутри одного бактериального вида (D.A.Peterson et al, 2008). К преимуществамэтого подхода относится быстрота выполнения, в частности обусловленнаявычислительнойгибкостью:существуетвозможностьэффективногораспараллеливания процесса вычислений.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
