Диссертация (1139725), страница 10
Текст из файла (страница 10)
«Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка влекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах») [17, 18, 19, 20].572.2.2 Выделение фракций из лекарственного растительного сырьядля изучения состава биологически активных веществДля изучения состава БАВ исследуемого ЛРС проводили последовательное фракционирование, а затем качественный и количественный анализ полученных извлечений. Выделение отдельных фракций необходимо для удалениямешающих веществ, уменьшения их влияния на анализ, получения более чистых проб. Для этого использованы растворители с постепенным повышениемполярности на каждом этапе, извлечение отделяли от ЛРС, а шрот просушивали.
Общая схема представлена на рисунке 14.Рисунок 14 – Схема выделения фракций из ЛРС для анализа БАВ58Полученные фракции после полного удаления растворителя взвешивали ипроводили их дальнейший анализ химическими, хроматографическими и спектроскопическими методами.2.2.3 Химические методы анализаВ исследованиях использовали качественные реакции на следующиегруппы БАВ: нафтохиноны (реакция окрашивания с раствором натрия гидроксида 5 %); алкалоиды (реакции осаждения с реактивом Драгендорфа, с реактивомВагнера-Бушарда); сапонины (реакция пенообразования); флавоноиды (цианидиновая проба); полисахариды (реакция осаждения со спиртом этиловым 95 %); дубильные вещества (реакция окрашивания с сульфатом железа (III)аммония).2.2.4 Хроматографические методы анализаДля идентификации и количественного определения БАВ в ЛРС и ЛРПиспользовали ТСХ (ОФС.1.2.1.2.0003.15 «Тонкослойная хроматография») [18].Подготовленные пробы и растворы СО наносили на хроматографические пластинки поршневыми микрошприцами c тупым концом иглы двумя способами: ввиде пятен (2-5 мм диаметром) с промежутками между ними не менее 10 мм и ввиде полос длиной от 10 до 20 мм с промежутком между ними не менее 10 мм.Подсушивание нанесенных проб осуществляли на воздухе или столе с электроподогревом.Хроматографические камеры предварительно насыщали парами смесейрастворителей в течение 20-30 мин, помещали в них пластинки с пробами иэлюировали восходящим способом.
Когда фронт подвижной фазы проходилрасстояние 10 см, пластинку вынимали из камеры, высушивали на воздухе доудаления следов растворителей. Пригодность подвижных фаз оценивали в со-59ответствии с требованиями ГФ XIII (ОФС.1.2.1.2.0001.15 «Хроматография»)[18].Детектирование зон адсорбции осуществляли следующими способами:– наблюдением под дневным светом;– наблюдением под УФ-светом;– опрыскиванием растворами обнаруживающих реагентов;– выдерживанием в парах обнаруживающего реагента.Интерпретацию результатов проводили, используя фактор удерживания(Rf), расчёт которого для каждой зоны адсорбции осуществляли с помощьюпрограммы Sorbfil TLC Videodensitometer.
Хроматограммы сканировали и данные полученного графического файла обрабатывали в программе. Каждой зонеадсорбции соответствует пик денситограммы. В отчёт выводилась сама денситограмма и таблица, в которой приводились значения Rf, площадь пиков (S),отношение площади каждого пика к сумме площадей всех пиков в треке (S %),высота пиков (H), отношение высоты каждого пика к сумме высот всех пиков втреке (%H). При нанесении на хроматограмму известного объёма извлечения ираствора СО известной концентрации рассчитывали содержание соединения вЛРС [50].Для идентификации и полуколичественного определения компонентовэфирногомаслаиспользовалигазовуюхроматографиюсмасс-спектроскопической детекцией (ГХ-МС) (ОФС.1.2.1.2.0004.15 «Газовая хроматография») [18]. Из ЛРС эфирное масло отгоняли с водяным паром и экстрагировали из отгона (с промыванием холодильника) диэтиловым эфиром.
Эфирные извлечения упаривали до маслянистого остатка под вакуумом при температуре не выше 35 °C, после чего остаток растворяли в гексане. Компонентныйсостав определяли методом хромато-масс-спектометрии на приборе ShimadzuGCMS-QP2010plus на колонке Supelco SLBTM-5ms (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) врежиме «split». Температуру колонки поднимали от 60 °C (выдержка 4 мин) до150 °C со скоростью 10 °C/мин, далее до 250 °C со скоростью 5 °C/мин. Температура инжектора, интерфейса и детектора были 250 °C. В качестве газа-60носителя использовали гелий чистотой 99,9999 % со скоростью потока1 мл/мин. Ионизация электронным ударом с энергией электронов 70 эВ.
Токэмиссии катода 120 мкА, диапазон регистрируемых ионов с m/z 45-600, скорость сканирования – 2500 m/z. Идентификацию компонентов проводили с использованием библиотек масс-спектров NIST08 и FFNSC. 1 мкл разведеннойпробы вводили в прибор с делением потока 1 : 40.ВЭЖХ-анализ (ОФС.1.2.1.2.0005.15 «Высокоэффективная жидкостнаяхроматография» [18]) проводили на хроматографе Summit фирмы Dionex(США), УФ-детектор UVD-170S, детекция при длинах волн 220, 254, 280 и430 нм, колонка Prodigy фирмы Phenomenex (5 мкм, ODS 3, 100 Ǻ) размером250 × 4,6 мм. Элюирование осуществлялось в градиентном режиме в подвижных фазах: А – 0,1 % водный раствор трифторуксусной кислоты, В – ацетонитрил.
Образцы перед анализом центрифугировали в течение 10 мин при12000 об./мин.2.2.5 Спектроскопические методы анализаЯМР-спектроскопию (ОФС.1.2.1.1.0007.15) использовали для идентификации СО нафтохинонов.Спектрофотометриювультрафиолетовойивидимойобластях(ОФС.1.2.1.1.0003.15) использовали как для идентификации нафтохинонов, таки для их количественного определения.2.2.6 Статистическая обработка результатов количественногоопределения биологически активных веществДля получения метрологических характеристик методик количественногоопределения БАВ проводили статистическую обработку выборок, полученныхпри анализе испытуемых образцов, с помощью программы Microsoft Excel сиспользованием критерия Стьюдента в соответствии с требованиями ГФ XI,ГФ XII и ГФ XIII [17, 18, 19].612.2.7 Валидация методик количественного определениябиологически активных веществВалидацию методик подтверждения подлинности и количественного определения нафтохинонов в ЛРС и фармацевтических субстанциях проводили,экспериментально оценивая линейность, специфичность, правильность, повторяемость, межоперационную точность, точность в соответствии с требованиямиГФ XIII (ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик») [18, 100].2.3 Дизайн исследованияРазработку методологических подходов к изучению ЛРС, содержащегонафтохиноны, и созданию на его основе ЛРП проводили в соответствии с дизайном исследования, представленному на рисунке 15.Рисунок 15 – Дизайн разработки методологических подходов к изучению ЛРС,содержащего нафтохиноны, и созданию ЛРП на его основе62ГЛАВА 3 ВЫЯВЛЕНИЕ ЗАВИСИМОСТИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙАКТИВНОСТИ НАФТОХИНОНОВ ОТ СТРУКТУРЫСОЕДИНЕНИЯ3.1 Структура и биогенез нафтохинонов1,4-Нафтохиноны – это циклические дикетоны, в основе молекул которыхлежит ядро нафталина, а кетогруппы расположены в пара-ориентации с сопряжёнными двойными связями (рисунок 16).
Часто хиноновый скелет содержитзаместители – метильные, гидроксильные и метоксильные группы. Фенольныегидроксогруппы могут быть гликозидированы [29, 240]. Также нафтохинонымогут образовывать окисленные и восстановленные формы (редокс-системанафтохинон – гидрохинон – нафтосемихинон), димеры и тримеры [6].Рисунок 16 – Строение нафтохинонов и редокс-система нафтохинон –гидрохинон – нафтосемихинонВ биосинтезе 1,4-нафтохинонов задействовано несколько сопряжённыхметаболических путей (рисунок 17) [155, 240]: шикиматный (из фосфоенолпирувата и эритрозо-4-фосфата); мевалонатный (из пирувата); поликетидный (из пирувата).63Ферменты гликолиза: Г6ФД – глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, 6ФГД – 6-фосфоглюконатдегидрогеназа, ФПИ – фосфопентоизомераза, ТК – транскетолаза, ТА – трансальдолаза.Ферменты пентозофосфатного пути: ФГИ – фосфогексозоизомераза, ФФК1 – фосфофруктокиназа-1, АЛД – альдолаза, ТФИ – трифосфатизомераза, ГАФД – глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназа, ФГК – фосфоглицераткиназа, ФГМ – фосфоглицератмутаза, ПК – пируваткиназа.Рисунок 17 – Схема основных путей биосинтеза нафтохинонов64Ядро нафталина в растениях наиболее часто синтезируется по шикиматному пути, который связан с образованием промежуточных соединений, ключевыми из которых являются шикимат, хоризмат, префенат и изохоризмат (рисунок 18) [102].Рисунок 18 – Схема начальных стадий шикиматного пути биосинтезанафтохиноновПо механизму образования префената синтезируются нафтохиноны – шиконин (через фенилаланин) и химафилин (через тирозин), изохоризмата – лавсон, лапахол, юглон и филлохинон (через о-сукцинилбензоат).
Некоторые боковые фрагменты молекул нафтохинонов синтезируются по мевалонатному пути (рисунок 19) [145, 240].65Ферменты шикиматного пути:BH4 – тетрагидробиоптерин,АКАФ14 - ацетил-кофермент А активирующий фермент изоформа 14+;ГКК - гидроксилаза коричной кислоты;ДАГФ-синтаза – 3-дезокси-D-арабино-гепт-2-улозонат-7-фосфатсинтаза;ДГНАТ – дигидроксинафтоаттиоэстераза;ДГХДГ – дегидрохиннат-дегидратаза;ДГХС – дегидрохиннат-синтаза;ЕПШФС – ЕПШФ-синтаза (5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтаза);ХС – хоризматсинтаза;ИХС – изохоризматсинтаза;ККЛ – кумароил-кофермент А-лигаза;НС – нафтоатсинтаза;ПГТ – п-гидроксибензоат-м-геранилтрансфераза;ПГФПГ – п-гидроксифенилпируват-гидроксилаза;ПФДГ префенатдегидратаза;ТАМ – трансаминаза;ТТАМ – тирозинтранаминаза;ФАЛ – фенилаланин-аммиак-лиаза;ХМ – хоризматмутаза;ШДГ – шикиматдегидрогеназа;ШК – шикиматкиназа.Ферменты мевалонатного пути биосинтеза нафтохинонов:ГМГ-коА - гидроксиметилглутарил-кофрментА-редуктаза;ГМГ-коА-С – гидроксиметилглутарил-кофрментА-синтаза;ИППФИ – изопентилпирофосфатизомераза;МК – мевалонаткиназа;МПФДК – мевалонат-5-пирофосфатдекарбоксилаза;ПДГК – пируватдегидрогеназный комплекс;ПТ – пренилтрансфераза;ФМК – фосфомевалонаткиназа.66Шикиматный путьCOO--COOCOO ПФДГCOOH ВН4изохоризматNH2тирозинТТАМтиолазаCOO---ацетоацетилкофермент АГМГ-коА-С2-сукценил-5-енолпирувил-6-гидрокси3-циклогексен-1-карбоксилатCOOГККCOOПГФПГS СоАCOOOHCOOS СоА3-гидрокси-3-метилглутарилкофермент А-ГМГ-коА-РOOHCOO(1R,6R)-2-сукценил-6-гидрокси-2,4циклогексадиен-1-карбоксилатHO-п-кумаратOOH гомогентизатCOO-МКOo-сукцинилбензоат-OS СоАOo-сукцинилбензоил-КоА-НСOHOH1,4-дигидрокси-2-нафтоил-КоАOHДГНАТOH5,8-дигидро-2,7-диметилнафтален-1,4-диолOHгеранилгидрохинонO-OH1,4-дигидрокси-2-нафтоатOH OH----OO O P O P OOOизопентенилпирофосфатИППФИПТ-OH3''-гидроксигеранилгидрохинонхимафиллин-OH OOOH OдезоксишиконинOH OшиконинOOOOHдеметилфиллохинонO OOHOH OюглонлапахолOO лавсон-OO O P O P OOOполипренилпирофосфатO1,4-нафтохинонOH-OO O P O P OOOгеранилпирофосфатOO--O OO P O P OOOмевалонат-5-пирофосфатOO O P O P OOOдиметилаллилпирофосфатOH OOФМКOМПФДКS СоАOH3-геранил-4-гидроксибензоатHOO OCOH OOH5-диметилаллил-2метилгидрохинон-O O P OOмевалонат-5-фосфатO OCCOOOHп-гидроксибензоатПГТCOOOHO-АКАФ14-OH2-метилгидрохинонOHмевалонатCOOп-кумарил-КоАCOOCH2OH-S СоАHOOHO-O OCККЛOHOHOO OC--O-OфенилпропенатOHгидроксифенилпируватOCOOOCH2ФАЛOOH OS СоАацетилкофермент АCH3пируватOOH-O OCфенилаланинCOO-H3C CПДГКC OCOOHNH2OHCOOOТАМOCOOCOOOHфенилпируватпрефенатHO-OOHOМевалонатныйпуть--OфиллохинонРисунок 19 – Схема шикиматного и мевалонатного путей биосинтезанафтохинонов и точки их сопряжения67Некоторые нафтохиноны, например дрозерон, плюмбагин, 7-метилюглон,синтезируются по поликетидному (ацетат-полималонатному) пути (рисунок 20).
В этом случае предшественниками ядра нафталина выступают поликетиды, образованные конденсацией нескольких ацетатных, малонатных илипропионатных единиц. В этом случае первичными ароматическими продуктамибиосинтеза являются нафтофенолы, которые далее окисляются до нафтохинонов [102].Ферменты поликетидного пути: ПДГК – пируватдегидрогеназный комплекс.COOПоликетидный путь-OПДГКC O3OCOOСоАSCH3пируваттиолазаCH Cацетилкофермент АO OCCH2OOOHCSСоАOH3-метилнафтален-1,8-диол4-[2-гидрокси-6-(2-оксопропил)фенил]2,4-диоксибутаноатO-OH-OOOмалонилкофермент АOHOHOдрозеронOHOплюмбагинOHO7-метилюглонРисунок 20 – Схема поликетидного (ацетат-полималонатного) пути биосинтезанафтохиноновТаким образом, были обобщены и систематизированы данные, составлены схемы биосинтеза основных нафтохинонов от процесса фотосинтеза до конечного соединения, выделены ключевые вещества и точки сопряжения метаболических путей.3.2 Зависимость фармакологической активности нафтохинонов отструктуры соединенияКоличество публикаций, посвящённым изучению новых фармакологических эффектов, возможных механизмов действия, токсичности растёт с каждымгодом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
