Диссертация (1139725), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Наибольшее число возможных побочных и токсических эффектов спрогнозировано для юглона (22), лавсона (18), 7-метилюглона(17) и филлохинона (17), наименьшее – изобутирилшиконина (1).1 – юглон, 2 – лавсон, 3 – плюмбагин, 4 – 7-метилюглон, 5 – дрозерон, 6 - химафилин, 7 – лапахол, 8 – дезоксишиконин, 9 – шиконин, 10 – филлохинон, 11 – ацетилшиконин, 12 – пропионилшиконин, 13 - β-оксиизовалерилшиконин, 14 – изобутирилшиконинРисунок 22 – Зависимость числа видов фармакологической активности отстроения нафтохиноновКак следует из данных, представленных на рисунке 22, наиболее простаяструктура обеспечивает широту спектра фармакологического действия, а введение заместителей в ядро нафтохинона приводит к снижению числа возможных видов активности. То же самое наблюдается при увеличении боковой углеводородной цепи. Однако эта особенность становится важной для поиска молекул с узконаправленным спектром терапевтического воздействия.
Из нафтохинонов группы шиконина наибольшую фармакологическую активность проявляют дезоксишиконин и шиконин. С увеличением числа атомов углерода в остатке молекулы этерифицируемой кислоты активность снижается.843.3 Выводы по главе1. Методом компьютерного моделирования in silico установлена зависимость в ряду «химическая структура соединения – биологическая активность» для нафтохинонов, характеризующаяся уменьшением числа видовфармакологической активности при введении метильных заместителей вароматическое ядро или увеличении боковой углеводородной цепи.2. Наибольшая широта терапевтического действия спрогнозирована для юглона и лавсона.3. Установлены предполагаемые побочные эффекты и возможное токсическое действие 14 нафтохинонов: дрожь, гепатотоксичность, подергивания, афтозные язвы.
Наибольшая токсичность спрогнозирована для юглона и лавсона, наименьшая – изобутирилшиконина.85ГЛАВА 4 СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВНАФТОХИНОНОВ, РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКАНАЛИЗА ЭТОЙ ГРУППЫ БАВ В ЛЕКАРСТВЕННОМРАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕДля надёжной стандартизации ЛРС и ЛФ необходимо иметь доступныеотечественные СО нафтохинонов. В рамках импортозамещения разработанытехнологии их получения как выделением из ЛРС (шиконина), так и путём химического синтеза (юглона).4.1 Получение стандартного образца шиконинаШиконин представляет собой 5,8-диокси-2-(4-метил-1-оксипент-3-енил)1,4-нафтохинон, C16H16O5. Синтез шиконина малоэффективен, наиболее высокий выход осуществляется при синтезе в шесть стадий [129].Разработанная технология получения шиконина основана на его способности в зависимости от рН среды находиться в форме основания, хорошо растворимого в неполярных средах, или соли, хорошо растворимой в воде и образованной с участием фенольного гидроксила (рисунок 23).OHOOH+ OHO-O-OOH-++HH3COHH3CCH3OCH3OРисунок 23 – Строение шиконина в основной и солевой формахШиконин выделяли из корней Echium russicum по модифицированной методике А.С.
Романовой и соавторов [99].С целью получения СО шиконина, измельчённые корни экстрагировалихлороформом в аппарате Сокслета до полного истощения ЛРС, которое оценивали визуально по окраске получаемых извлечений. Объединенные извлеченияконцентрировали отгонкой хлороформа, затем очищали на хроматографическойколонке (диаметр – 2 см, сорбент – силикагель (10 г), элюент – хлороформ).86Элюат помещали в делительную воронку, затем экстрагировали фракцию нафтохинонов раствором натрия гидроксида 10 %, степень экстракции также оценивали визуально.
Далее осуществляли щелочной гидролиз сложных эфировнагреванием на водяной бане при температуре 60 C в течение 15 минут. Затемсмесь охлаждали и фильтровали через бумажный фильтр. К полученному извлечению порциями при интенсивном перемешивании прибавляли кислотухлористоводородную концентрированную до образования осадка. Надосадочную жидкость декантировали, осадок собирали на фильтре, промывали водойдо отрицательной реакции на хлорид-ионы, высушивали сначала на воздухе,затем в эксикаторе над кальция хлоридом.Разработана технологическая схема производства СО шиконина (рисунок 24) и составлен материальный баланс (таблица 15).Таблица 15 – Материальный баланс на серию готового продукта СО шиконинаИзрасходованоПолученоНаименование конечногоНаименование сырья, полупродуктов и Масса,продукта, полупродуктов,используемых отходовкготходов и потерьСырье:Готовый продукт:1.
Синяка русского корни с влажностью не 0,520 1. Шиконин – СОболее 10 % (10 %), в т.ч.:- содержание суммы нафтохинонов в пе- (0,0051)ресчете на шиконин не менее 1 % (1,1 %)2. Хлороформ17,1353. Раствор натрия гидроксида 10 %1,0504. Кислота хлористоводородная концентрированная5. Вода очищенная0,386Масса, кг0,0023 кг5,00Отходы используемые:2. Хлороформ(регенерированный)Отходы неиспользуемые:3.
Шрот на утилизацию4. ОсадокИтого: 24,09112,9631,8600,0495. Кисло-водный маточник1,3706. Вода промывная5,007. Примеси (со стадии ПО 14)0,298Потери механическиенеучтенные2,5487Итого: 24,09187Рисунок 24 – Техологическая схема производства СО шиконина88Выход шиконина составил 45,1 % от содержания суммы нафтохинонов вЛРС.Физико-химические свойства и характеристики полученного шиконинасравнивали с таковыми достоверного образца компании Sigma-Aldrich (CAS№54952-43-1), выделенного из корней Arnebia sp.
(сем. Boraginaceae). Эти показатели шиконина-СО легли в основу составленных норм качества, приведённых в таблице 16.Таблица 16 – Нормы качества СО шиконинаНаименование показателяНормаВнешний видКристаллический порошок тёмно-красного цветаРастворимостьЛегко растворим в спирте, эфире, хлороформеПодлинностьЯМР-1Н-спектр шиконина – СО в ацетоне долженсодержать только сигналы, соответствующие эталонномуспектру (рисунок 25)УФ-спектр 0,002 % раствора шиконина-СО в хлороформедолжен иметь в области от 250 до 600 нм максимумыпоглощения при (273 ± 2) нм, (492 ± 2) нм, (525 ± 2) нм,(565 ± 2) нм (рисунок 27)Удельный показатель1%поглощения A1см422-438Температура плавления, °C143-147Вода, % не более0,5Химическая чистота, %не менее99,5Внешний вид определяли визуально на белой фильтровальной бумаге.Для подтверждения подлинности использовали ЯМР-1Н-спектроскопию,ИК-спектроскопию и УФ-спектрофотометрию:1.
ЯМР-1Н-спектроскопияОколо 0,02 г СО шиконина растворяли в 0,5 мл дейтерированного ацетона. ЯМР-1Н-спектр (рисунок 25) регистрировали на спектрометре VarianGemini 200 согласно ГФ XIII ОФС.1.2.1.1.0007.15 [18].6 Oct 2015ОС5491 шиконин №2 ЗИ ацетон 6-10-15 G-200 1H89Acetone-d61211109876Chemical Shift (ppm)54321Рисунок 25 – ЯМР-спектр шиконина2. ИК-спектроскопияДля получения ИК-спектра прессовали таблетку из смеси шиконина с калия бромидом в соотношении 1 : 150, которую помещали на пути луча в спектрометре ИКС-40.
Полосы поглощения полученного спектра соответствуютхимической структуре шиконина (рисунок 26).Рисунок 26 – ИК-спектр шиконина в калия бромиде3. УФ-спектрофотометрияОколо 0,05 г СО шиконина помещали в мерную колбу вместимостью100 мл, прибавляли 80 мл хлороформа, растворяли при перемешивании и затемдоводили объём тем же растворителем до метки, снова перемешивали (раствор А). 1 мл раствора А переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, до-90водили объём раствора хлороформом до метки и перемешивали (раствор Б).Оптическую плотность раствора Б измеряли в диапазоне длин волн 250-600 нмсогласно ГФ XIII ОФС.1.2.1.1.003.15 [18].
УФ-спектр представлен на рисунке 27.Рисунок 27 – УФ-спектры поглощения раствора шиконина в хлороформе вконцентрациях (4-14) мкл/мл1%Для определения удельного показателя поглощения ( A1см ) шиконина вхлороформном растворе строили график зависимости оптической плотностипри длине волны 525 нм от концентрации (рисунок 28).1,4Ay = 419,65x + 0,00831,2R2 = 0,999910,80,60,40,2%000,00050,0010,00150,0020,00250,0030,0035Рисунок 28 – Зависимость оптической плотности раствора шиконина вхлороформе от его концентрации при длине волны 525 нм91Уравнение линейной зависимости и величина достоверности аппроксимации были определены при помощи программы Microsoft Excel. Полученныезначения указывают на то, что данная зависимость вида y = b·x + a имеет линейный характер, величина достоверности аппроксимации R2≥0,98, что позволяет использовать методику для определения шиконина.
Удельный показательпоглощения шиконина рассчитывали, используя полученное уравнение для15 точек (таблица 17).Таблица 17 – Расчёт удельного показателя поглощения шиконинаКонцентрацияшиконина, %А1%A1см0,000450,197438,09Метрологическиехарактеристикиn = 150,000500,218436,25Xср. = 429,860,000550,239434,74S = 1,240,000600,260433,48tP(f) = 2,140,000650,281432,42Δх = 2,650,000700,302431,51 = ± 0,62 %0,000750,323430,720,000800,344430,030,000850,365429,410,000900,386428,870,001000,428427,950,001500,638425,180,002000,848423,800,002501,057422,970,003001,267422,42Как следует из данных, представленных в таблице 17, относительнаяошибка определения удельного показателя поглощения составила 0,62 %, чтоговорит о высокой достоверности полученной величины.924.2 Усовершенствование и валидация методик анализа шиконина влекарственном растительном сырьеРанее разработанные нами методики качественного и количественногоанализа шиконина в корнях Echium russicum [32] усовершенствованы и валидированы в соответствии с ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик»ГФ XIII [18].4.2.1 Качественный анализ шиконинаКачественный анализ шиконина и его производных проводили по оригинальной методике: около 1,0 г (точная навеска) корней Echium russicum, измельчённых до размера частиц 2 мм, помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 15 мл хлороформа, присоединяли обратный холодильник и нагревали 15 минут на водяной бане при температуре 60 °C, затемохлаждали, извлечение фильтровали через бумажный фильтр «красная лента» вмерную колбу вместимостью 50 мл.
Фильтр с частицами ЛРС возвращали вколбу со шлифом, прибавляли 15 мл хлороформа и операцию повторяли ещёдважды. Извлечение в мерной колбе доводили хлороформом до метки и перемешивали (испытуемый раствор).В делительную воронку объёмом 125 мл помещали 5 мл испытуемогораствора, имеющего красный цвет различной степени интенсивности, прибавляли 10 мл раствора гидроксида натрия 5 %, встряхивали в течение 5 минут,наблюдали обесцвечивание хлороформного слоя, и окрашивание водного в синий цвет, что свидетельствовало о наличии шиконина и его эфиров.Идентификацию шиконина и его производных в ЛРС проводили методомТСХ.
Наносили микрошприцем по 0,02 мл хлороформного извлечения и раствора СО шиконина на линию старта хроматографической пластинки, подсушивали на воздухе, помещали в камеру, предварительно насыщенную парамисмеси 1 (петролейный эфир – диэтиловый эфир 10 : 3,5) или смеси 2 (гексан –ацетон 20 : 1). Шиконин и его эфиры идентифицировали в виде зоны адсорбции93розового, красного или красно-фиолетового цвета, меняющей окраску на синюю при обработке парами аммиака (рисунок 29).Линия финишаШиконин1Линия старта231 – хроматограмма без обработки; 2 – хроматограмма и после обработки парами аммиака;3 – схема хроматограммыРисунок 29 – ТСХ хлороформного извлечения из корней Echium russicumХроматографирование проводили с использованием СО шиконина, рассчитывая величины факторов удерживания (Rf). Результаты детектированиянафтохинонов представлены в таблице 18.Таблица 18 – Результаты детектирования нафтохинонов в корнях EchiumrussicumОкраскаRfОбразецсмесь 1смесь 2без обработкиЛРС0,10,20,40,60,10,20,40,5краснаякраснаякраснаякраснаяпосле обработкипарами аммиакасиняясиняясиняясиняяШиконин СО0,20,2краснаясиняяИсходя из хроматографического поведения шиконина и его производных,для дальнейшего анализа использовали смесь 1.944.2.2 Экспресс-анализ лекарственного растительного сырья насодержание шиконинаДля экспресс-определения содержания нафтохинонов в корнях синякарусского разработана методика хромато-денситометрического анализа с использованием СО шиконина.Расчёты проводили с помощью градуировочного графика, для построениякоторого использовали раствор СО шиконина 0,05 % в спирте этиловом 95 %.На линию старта хроматографической пластинки марки TCL Silica gel 60 F254Merck KgaA размером 15 × 15 см наносили микрошприцем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 мклраствора шиконина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
