Диссертация (1139716), страница 48
Текст из файла (страница 48)
Бронхолитическая активностьИсследование бронхолитической активности выполнено совместно с сотрудниками кафедры фармакологии № 2 ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава Россиипод руководством д.м.н., проф. Насырова Х.М.Бронхолитическую активность изучали на наркотизированных (нембутал30 мг/кг, внутрибрюшинно) кошках обоего пола массой 2,3-2,4 кг. Тонусбронхов регистрировали с помощью методики Концетта и Рослера в модификации Т. М. Турпаева [145]. Экспериментальный бронхоспазм вызывали прозерином (0,25 мг/кг) и карбахолином (5 мкг/кг).
Исследуемые соединения ииспользуемый для сравнения эуфиллин (ОАО «Ирбитский химфармзавод»,Россия) вводили на высоте бронхоконстрикции внутривенно в дозе 8 мг/кг(ЕD50) в виде водных растворов.Обработку полученных результатов проводили с применением методоввариационной статистики. В сравниваемых группах определяли средние величины (М), ошибку средних величин (±m). Сравнение результатов экспериментов проводили по критериям Фишера (F) и Стьюдента (t) (табл. 3.19) [24]. Минимальный уровень достоверности верифицировали при р<0,05.
Математическую обработку выполняли на компьютере с применением программногообеспечения Microsoft Excel.Проведенные исследования показали, что 6-аминопроизводные 1,3диметилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона оказывают бронхолитическое действие вразной степени (табл. 3.18) [65].Соединения 2.302, 2.305 не вызывали снижения тонуса бронхов в исследуемойдозе.Введениевструктурудиметилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона6-аминопроизводныхфенильныхрадикалов1,3-(соединения2.310, 2.312) или гетероциклизация с образованием пиразино[1,2-е]пурин2,4(1Н,3Н)-диона (соединение 2.322) приводит к появлению бронхолитическойактивности.Наиболееактивен6-(4-бензилпиперазин-1-ил)-1,3-диметилпиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона дигидрохлорид (2.312), который по силедействия в 1,5 раза превосходит эталонный бронхолитик эуфиллин [11].341Таблица 3.18Бронхолитическая активность и острая токсичность 6-аминопроизводных пиримидин-2,4(1Н,3Н)-дионаСоединение КоличествоСнижениеLD50, мг/кгживотныхбронхоспазма, %,(М ± m)12эффект отсутствует2.30212эффект отсутствует2.3052027,0±2,72.3102060,3±2,8125,0 (93,9÷166,2)2.312159,1±3,72.322Эуфиллин1840,1±4,2175,0 (158,6÷193,0)Таблица 3.19Сравнительное влияние исследуемых соединений и эуфиллина на бронхоспазмСоединениеF-критерийt-критерийЭуфиллин – соединение 2.3101,2600,673Эуфиллин – соединение 2.3122,2960,912Эуфиллин – соединение 2.3221,2030,565Соединение 2.312 было исследовано более углубленно.
Острую токсичность определяли на белых беспородных мышах обоего пола массой 20-25 г(группа 20 мышей) по методу Litchfield J. и Wilcoxon F. в модификации Рота[10]. Исследуемые соединения вводили внутрибрюшинно, выживаемость животных наблюдали в течение 14 суток. Соединение 2.312 и эуфиллин при внутрибрюшинном введении относятся к малотоксичным веществам (табл. 3.18)[110].Бронхоспазмолитическую активность соединения 2.312 и препаратасравнения – эуфиллина изучали на препарате гладких мышц открытых трахеальных колец морской свинки [155].
Нагрузка на трахеальные кольца составляла 2 г, длительность экспозиции исследуемых соединений – 4 мин.Исследования показали, что соединение 2.312 не уступает по активностиэуфиллину при карбахолиновом спазме (10-3 М). Величина ЕС50 составила2,7·10-4 (2,2÷3,5) М и 3,4·10-4 (3,5÷4,6) М соответственно Отличительнымсвойством соединения 2.312 оказалось отсутствие релаксирующего эффекта вдозах до 3·10-4 М при спазмах гладких мышц трахеи морской свинки, вызван-342ных хлоридом бария (10-3 М), что позволяет предположить отсутствие прямогомиотропного компонента действия при наличии выраженного холинолитического [50].4.7. Токсичность тиетансодержащих пиримидин-2,4(1Н,3Н)-дионовЦитотоксичность 33 новых производных пиримидин-2,4(1Н,3Н)-дионовизучена в лаборатории молекулярной фармакологии и иммунологии Института биохимии и генетики ФГБУН ИОрХ УНЦ РАН под руководством д.б.н. Вахитовой Ю.В.Цитотоксичность синтезированных соединений определяли по автоматизированному флуоресцентному тесту на основании использования реагентаPresto Blue (Invitrogen) спектрометрическим методом в микропланшетномформате [231].
Presto Blue представляет собой нефлуоресцирующий витальный краситель ресазурин, который при восстановлении в метаболическиактивных клетках превращается в флуоресцентный продукт ресоруфин. Падение флуоресценции в присутствии тестируемого соединения отражает снижение жизнеспособности клеток и используется для измерения цитотоксичности.Тест-системами служили условно-нормальные клетки почки человека(HEK293, линия эмбриональной почки человека) и клеточная линия опухолевого происхождения (HepG2, гепатоцеллюларная карцинома). Все веществарастворяли в ДМСО. Культивирование клеток осуществляли в 100 мкл средыDMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ФБС), при 37°Св атмосфере 5% СО2 96-ти луночных планшетах.
После 24 ч инкубации к культурам клеток добавляли исследуемые соединения в концентрациях 100, 10, 1мкМ (соединения 2.43, 2.54, 2.66-2.70 в концентрациях 10, 1, 0,1 мкМ) и продолжали культивирование клеток в тех же условиях в течение 48 ч (для каждой концентрации эксперименты были выполнены в трех повторностях). После инкубации с соединениями в каждую лунку вносили краситель Presto Blueс конечной концентрацией 10% и планшеты инкубировали в течение 4 ч. Флуоресценцию измеряли на анализаторе 2300 EnSpire Multimode Plate Readers343(Perkin Elmer, США) при длине волны возбуждения 530 нм, эмиссии при 590нм.Вычисление значений IC50, характеризующих параметры цитотоксичности (концентрация соединения, необходимая для 50% ингибирования жизнеспособности клеток in vitro), и EC50 (концентрация соединения, необходимаядля увеличения жизнеспособности клеток in vitro на 50%) проводили в программах Excel и GraphPad Prism v.5.0.Таблица 3.20Цитотоксическое действие тиетансодержащих производных пиримидин2,4(1Н,3Н)-дионаСоединениеIC50 для НЕК293, ЕC50 для НЕК293, IC50 для HepG2,мMмMмM1,802.550,642.662,802.690,882.1550,442.156Результаты скринингового теста показали, что исследуемые 3-(тиетан-3ил)- (2.33), 3-(1-оксотиетан-3-ил)- (2.43) и 3-(1,1-диоксотиетан-3-ил)-6-метилпиримидин-2,4(1H,3H)-дионы (2.45); С5-аминометилпроизводные 2.49, 2.51,2.53, 2.54, 2.59, 2.60, 2.62, 2.64, 2.67, 2.68, 2.70; N1-(аминооксоэтил)производные 2.123, 2.127, 2.131, 2.133, 2.136, 2.138, 2.140; N1-ацетанилиды2.142, 2.146, 2.147, 2.152, 2.155, 2.156, 2.160, 2.164, 2.165 и 6-метилурацил 2.1 вконцентрациях 100, 10, 1 и 0,1 мкМ не обладают цитотоксическим действием вотношении клеток линии HEK293.
6-Метил-5-(морфолин-4-илметил)-3-(1оксотиетан-3-ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-дион (2.55) в концентрации 1,8 мМувеличивает жизнеспособность клеток HEK293 in vitro на 50%, а пиперазинометилпроизводные 3-(1-оксотиетан-3-ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона 2.66 и2.69 в концентрациях 0,64 и 2,8 мM соответственно ингибируют жизнеспособность клеток HEK293 in vitro на 50% (табл. 3.20). N1-Ацетанилидпроизводные2.155 и 2.156, содержащие тиетан-1-оксидный цикл, в концентрациях 0,88 и0,44 мM соответственно ингибируют жизнеспособность клеток HepG2 in vitro344на 50% и не оказывают цитотоксического действия в отношении клеток линииHEK293, что показывает перспективность дальнейших исследований данныхсоединений и поиска противоопухолевых лекарственных средств в ряду тиетансодержащих пиримидин-2,4(1Н,3Н)-дионов.Острая и субхроническая токсичность, тератогенность наиболее активных соединений изучена в центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России под руководством к.м.н., доцентаГалимовой Р.А.Острую токсичность (LD50) определяли на белых беспородных мышахобоего пола массой 18-22 г (группа 20 мышей) по методу Litchfield J.
и Wilcoxon F. в модификации Прозоровского В.Б. [88]. Исследуемые соединениясуспендировали в Твин-80 и вводили однократно перорально и/или внутрибрюшинно, наблюдение за животными проводили в течение 14-30 суток.Тестированные дозы при внутрибрюшинном введении составили 1000,2500, 4000 и 5000 мг/кг, при пероральном - 1000, 2500 и 4000 мг/кг. Суспензиисоединений вводили в объѐмах 0,4-0,8 мл на 20 г массы животных. Дальнейшее повышение концентрации испытуемых соединений требовало увеличениеобъѐмов вводимых суспензий, что превышало допустимые нормативы [104].Полученные данные свидетельствуют об отсутствии летальных исходову экспериментальных животных при введении соединений 2.33, 2.35, 2.45 в тестированных дозах в течение 14–30 дней (табл.
3.21). За время экспeриментане наблюдалось изменений в поведенческих реакциях, внешнего вида, не былопроявлений симптомов интоксикации у мышей опытной группы по сравнениюс животными контрольной группы. Путь введения не оказал существенноговлияния на показатели острой токсичности.В группе животных, получавших соединение 2.43, после введения нетоксической дозы наблюдались единичные клонические судороги, потягивание, тахипноэ, некоторое обездвиживание (животные не двигались в течение2-3 ч, не принимали пищу в течение 4-5 ч).
Через сутки указанные явленияпроходили. При введении соединений 2.149, 2.277, 2.283 наблюдалось обрати-345мое явление периферической нейропатии. При введении дозы LD50 соединений 2.43, 2.49, 2.149, 2.220, 2.249, 2.277, 2.283 (табл. 3.21) гибель половиныживотных происходила через 2-6 ч от остановки дыхания и сердца, предварительно наблюдались единичные тонико-клонические судороги, в случае соединения 2.43 - цианоз, тахипноэ.Таблица 3.21Острая токсичность тиетансодержащих пиримидин-2,4(1Н,3Н)-дионовСоединение КоличествоПуть введенияLD50, мг/кгживотных20перорально>40002.3320внутрибрюшинно>500020перорально>40002.3520внутрибрюшинно>500030внутрибрюшинно2400 (1655÷3480)2.4320перорально>40002.4520внутрибрюшинно>500020внутрибрюшинно1650 (1480÷1930)2.4920внутрибрюшинно2800 (1400÷4050)2.14920внутрибрюшинно1815 (1630÷2005)2.22020внутрибрюшинно3200 (1770÷3990)2.24920внутрибрюшинно1580 (1300÷1890)2.27720внутрибрюшинно1690 (1440÷2120)2.283Таким образом, соединения 2.33, 2.35, 2.45 при пероральном и внутрибрюшинном введении относятся к классу относительно безвредных веществ, асоединения 2.43, 2.49, 2.149, 2.220, 2.249, 2.277, 2.283 при внутрибрюшинномвведении - к классу практически нетоксичных соединений по классификацииСидорова К.К.
[34]. Следует отметить, что 6-метилпиримидин-2,4(1Н,3Н)дионы, содержащие тиетановый и тиетан-1,1-оксидный циклы, менее токсичны тиетан-1-оксидсодержащего аналога.Исследованы субхроническая токсичность и тератогенные свойства 6метил-3-(тиетан-3-ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона (2.33).Исследование субхронической токсичности проводилось методом ЛимР.К., позволяющим определить как кумуляцию, так и привыкание к препарату.Для изучения субхронической токсичности ежедневно в течение 24 дней жи-346вотным вводили соединение 2.33, начиная с 500 мг/кг внутрижелудочно, каждые 4 дня увеличивая дозу на 100 мг/кг.
У испытуемых животных не менялисьповеденческие реакции, масса тела, гибели животных не наблюдалось. Можнопредположить отсутствие привыкания и кумулятивных свойств у 6-метил-3(тиетан-3-ил)пиримидин-2,4(1Н,3Н)-диона, так как суммарная доза за 24 днясоставила 18000 мг/кг массы.Тератогенные свойства изучались на 2-х группах белых мышей. Контрольные животные получали физиологический раствор NaCl. Регистрироваликоличество новорожденных крысят, дни отлипания ушных раковин, открывания глаз, поведенческие реакции, прирост массы тела, данные лабораторныханализов крови.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
