Диссертация (1139634), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Культурасостояла из мезенхимальных стволовых клеток лошади (МСК), а изучалисьпоказатели цитотоксичности и ростовой активности клеток. Помимоуказанных сплавов в исследовании в качестве субстратов для пролиферацииМСК использовались сплав никелид титана и титан.Из Коллекции клеточных культур тканей Института вирусологии им.Д.И. Ивановского ФГБУ НИЦ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи Минздрава России выбраны нормальные мезенхимальныестволовые клетки лошади (МСК) для последующего культивирования в средеDMEM (производства ФГБНУ ФНЦИР иммунобиологических препаратов им.М.П. Чумакова РАН).
КультураклетокМСК лошадисостоит изфибробластоподобных и полигональных клеток с ядрами овальной формы;ядрышки крупные по 1-4 в ядре; цитоплазма мелкосетчатая.С целью оценки биосовместимости и влияния на ростовую активностьклеток МСК лошади сплавов титана применяли МТТ-тест [153]. МТТколориметрический тест служит биологическим стандартом и рекомендован вэтом качестве для оценки цитотоксического действия различных чужеродныхвеществ на клетки. Тест основан на прямой коррекции количестважизнеспособных клеток и интенсивности метаболизма специального реактиваМТТ до водорастворимого темноокрашенного формазана под действиеммитохондриальной сукцинатдегидрогеназы тогда, как мертвые клетки иклетки со сниженной жизнеспособностью такой способностью не обладают.Последующая фотометрия растворенного с помощью ДМСО формазанапозволяет точно сопоставить изменение оптической плотности раствора поотношению к контролю с изменением количества жизнеспособных клеток, а вцитотоксических исследованиях оценить специфическую гибель клеток,индуцированную тем или иным цитотоксическим агентом.57Для стерилизации образцов проводили автоклавирование их при 1 атм.120ºС в течение 30 мин.Дляопределениявлияниянаростовуюактивностьклетокавтоклавированные образцы укладывались в лунки 24-луночного планшета«Costar» (США).
Суспензия клеток в посевной дозе 100000 кл/мл в средеDMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (НПО«ПанЭко», Москва) вносилась в каждую лунку планшета. Планшеты собразцами и клетками инкубировались в термостате СО2 при 37°С в течение96 часов. Контролем служили лунки с клетками без образцов. Послеинкубации культуральную среду удаляли (отсасывали из лунок) и проводилиМТТ-реакцию. Добавляли по 1мл среды с 200 мкл МТТ (3[4,5-диметил-тиазол2-ил]-2.5-дифенилтетразолия; «Sigma», США) в исходной концентрации 5мг/мл и инкубировали в течение 4 часов.
Затем среду с МТТ удаляли идобавлялипо1млдиметилсульфоксида(ДМСО)длярастворенияобразовавшихся кристаллов формазана. Осадок клеток ресуспендировали втечение 5 мин пипетированием. Жизнеспособность клеток оценивали поинтенсивности окраски раствора, измеряя оптическую плотность при длиневолны 545 нм фотометра Immunochem 2100 (HTI, США) (Рис. 7-9).Рисунок 7 – Образцы титановых сплавов в лунках 24 луночной панели58Рисунок 8 – Образцы титановых сплавов в лунках 24 луночной панелис внесенной клеточной суспензией в концентрации 100 тыс.кл/млРисунок 9 – Постановка МТТ-метода через 96 часов инкубацииобразцов титановых сплавов с МСК и после инкубации в течение 4 часовв среде с МТТВизуальное изучение морфологии неокрашенных и окрашенных клетокпроводили микроскопически. Монослой выросших на дне лунок клетокизучался визуально в световом микроскопе «Olympus СКХ41» (Olympus,Япония), снимался смесью 0.02% Версен-Химопсин и разводился в 1 мл средыИгла для подсчета пипеткой Scepter Millipore (Merck, Германия) (Рис.
10).59Рисунок 10 – Световая микроскопия неокрашенных клеток МСКПодсчет выросших клеток и их гистограммы производили с помощьюприжизненного окрашивания клеток этидиумом бромидом и ручногоавтоматизированного счетчика клеток – пипетки Scepter Millipore (Merck,Германия), которая позволяет получить данные о популяции клеток,концентрации, распределению по размеру и объему (Рис. 11).Рисунок 11 – Ручной автоматизированный счетчик клеток – пипеткиScepter Millipore с гистограммой анализа контроля клеток МСКДля определения влияния на морфологию клеток образцы сплавовинкубировались в лунках планшета, на дно которых предварительно уложеныпокровные стекла. Затем в культуральную среду добавляли этидиум бромиддо конечной концентрации 1 мкг/мл и инкубировали 5 мин.
в термостате СО2при 37°С., клетки 3 раза промывали средой без сыворотки и покровные стекла60с окрашенными клетками вынимались и изучались в флуоресцентноммикроскопе «Opton Axioskop» (Carl Zeiss, Германия), а также Olympus BX43(Съемка с объективами:1) 40x – общее увеличение 40x10x0,63 = 252,2) 20x –общее увеличение 20x10x0,63 = 126) (Рис. 12).Рисунок 12 – Контроль клеток МСК, флуоресцентная микроскопия.Увеличение 20х2.5. Экспериментальное изучение остеоинтеграции сверхупругихсплавов титанаСпособность к остеоинтеграции сверхупругих сплавов титан-ниобийтантала и титан-ниобий-циркония оценивалась в сопоставлении с сплавомтитана на экспериментальных животных [30,88,119,168,186,222,225,238,286].Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособностиКазанского федерального университета и субсидии, выделенной Казанскомуфедеральному университету для выполнения государственною задания всфере научной деятельности.
Анализы выполнены в лаборатории лазернойконфокальной микроскопии Междисциплинарного центра аналитическоймикроскопии.РаботаМеждисциплинарногочастичноцентравыполненаколлективногонаоборудованиипользованияКазанскогофедерального университета при финансовой поддержке государства в лицеМинобрнауки России (ID RFMEN59414X0003) и Научно-образовательного61центрафармацевтикиКазанского(Приволжского)федеральногоуниверситета.Экспериментальным животным кроликам породы «Серый Великан» вколичестве 18 животных с средней массой 2500 грамм под внутримышечным2%рометаровымнаркозомпроизводилиразрездлиной4смвподнижнечелюстной области угла нижней челюсти; скелетировали наружнуюповерхность челюсти и формировали отверстие диаметром 4мм и глубиной2мм с последующим введением в костное ложе с усилием образцов сплавов(Рис.
13). После обработки раны 3% перекиси водорода ее послойно ушивали.Животных выводили из опыта в сроки 30 и 90 дней внутримышечнымвведением 6мл калипсола, производили забор костных блоков, которыепомещаливраствор10%нейтральногоформалина;проводилирентгенологический контроль на аппарате Pan Exam+ (Kavo) (Рис. 14).Методика проведения сканирующего электронно-микроскопическогоанализаМетод основан на зондировании поверхности изучаемого образцаэлектронным зондом. Поверхность массивного образца облучается тонкосфокусированным (диаметром до 5-10 нм) пучком электронов, такназываемым электронным зондом.
Пучок электронов совершает возвратнопоступательное движение по линии или развертывается в растр –совокупность близко расположенных параллельных линий, вдоль которыхпучок электронов обегает выбранный для исследования участок поверхности.Растровый измерительный электронный микроскоп c камерой низкоговакуума обеспечивает мeтрoлoгические пaрaметры измерeний линейныхрaзмерoв субмикрoннoго диапазона и массовой дoли элементoв в сoставеисследуемых объектов.Предварительный просмотр образцов осуществлялся посредствомоптического микроскопа при увеличении 50х, 100х и 200х.
Затемзафиксированные на держатель образцы помещались в камеру вакуумнойустановки Q 150T ES (Quorum Technologies) для нанесения проводящего слоя62методом катодного распыления сплава Au/Pd в соотношении 80/20; толщинананесенного слоя 15нм.Измерения проводились на автоэмиссионном высокоразрешающемсканирующем электронном микроскопе Merlin (Carl Zeiss) (Рис. 15).Микроскоп оснащен спектрометром энергетической дисперсии AZtec X-Max(Oxford Instruments) с разрешением спектрометра 127эВ; точность измерениясоставляет 0.01-1%. Съемка морфологии поверхности проводилась приускоряющем напряжении первичных электронов 5кВ и зондовом токе 300пАдля минимального воздействия на объект исследования.Элементный рентгеновский микроанализ проводился при ускоряющемнапряжении 20 кэВ и рабочем отрезке 10 мм с использованием набoраэталoнов для количественнoго микрoанализа, что позволяет избежатьминимальных погрешностей для микрозондового анализа на электронноммикроанализаторе EVO GM (Carl Zeiss); глубина зондирования составляетпорядка 1 мкм; предел обнаружения 1500-2000 ррм (Рис.
16).63Рисунок 13 – Ход операции имплантации у экспериментальных животных64Рисунок 14 – Рентгенограммы блоков костной ткани животныхс образцами сплавов65Рисунок 15 – Универсальный аналитический комплекс сканирующейавтоэмиссионной электронной микроскопии Merlin (Carl Zeiss)Рисунок 16 – Электронный микроанализатор EVO GM (Carl Zeiss)662.6. Методы статистического анализаНа первом этапе проведены тесты на нормальность для каждойколичественной переменной для каждой группы с помощью критерияКолмогорова-Смирнова. В связи с несоответствием критерию нормальногораспределения для некоторых переменных сравнительные анализы проведеныс использованием непараметрических критериев.
В частности сравнениеколичественныхпеременныхвтрехгруппахпроизводилосьнепараметрическим критерием Крускала-Уоллиса. Сравнительный анализкатегориальных переменных произведен с помощью критерия χ2 или точногокритерия Фишера. Для сравнения таблиц сопряженности 2х2 использованапоправка Йейтса.Описательная статистика количественных переменных представленасреднимизначениями[150,157,209,211,227,263,275].истандартнымиРезультатыошибкамикатегориальныхсреднегопеременныхпредставлены в таблицах в виде n / %, т.е. число пациентов с наличием данногопризнака с указанием процента от общего числа пациентов в группе.Результаты сравнительных анализов представлены в виде таблиц суказанием значений р для каждого сравнения.Анализ проведен с помощью программ IBM SPSS Statistics v 20, Statistica10.0 и Microsoft Excel 2016.
Различия между группами считаютсястатистически значимыми при значении р<0,05.67Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ3.1. Дифференцированный анализ причин осложнений дентальнойимплантации в отдаленные сроки после завершения протезированияСредивсех1149анализируемыхвнутрикостныхдентальныхимплантатов из титана периимплантит с резорбцией костной ткани на 1/2длины имплантата выявлен у 9,5% имплантатов (109 имплантатов), а былиудалены 6,2 % (71 имплантат) (Рис. 17).С увеличением срока нагрузки внутрикостных имплантатов количествоосложнений увеличивается: при эксплуатации 5-6 лет число имплантатов спериимплантитом составило 3,1% (17 имплантатов), а удаленных 2% (11имплантатов); при эксплуатации 7-8 лет – соответственно 5,6% и 7,6%, 9-10лет – 6,9% и 7,7%. Значимое увеличение количества осложнений происходилочерез 7-8 лет после окончания протезирования.%7,77,66,985,663,142,0205-6 лет7-8 летпериимплантит9-10 летудаленыРисунок 17 – Динамика выявления осложнений имплантациив зависимости от срока эксплуатации имплантатаИмплантаты, функционирующие у пациентов без соматическихзаболеваний имели меньшее количество осложнений в сравнении с лицами собщесоматическими заболеваниями: периимплантит соответственно у 6,9%имплантатов и 11,1%, удалены 5,1% и 6,9% имплантатов.68При наличии пародонтита количество осложнений существенно вышепо сравнению с имплантатми у здоровых лиц: периимплантит соответственноу 72 и 37 имплантатов (11,4% и 7,2%), удалений 50 и 21 имплантатов (7,9% и4,1%).При анализе зависимости числа осложнений от локализации имплантатаустановлено:наверхнейчелюстиосложненийнесколькобольше(периимплантит 11,4%, 70 имплантатов; удалены 6,7% имплантатов, 41имплантатов против 7,3%, 39 имплантатов и 5,6%, 30 имплантатов на нижнейчелюсти).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
