Диссертация (1139576), страница 21
Текст из файла (страница 21)
инкубацииаба — адгезияб — микроколониивв — зрелая биопленкаРис. 10. Этапы формирования биопленки P. aeruginosa116а — адгезия и ростовая трубка; б — микроколонии и бластоспорыв — зрелая биопленка со сформированным псевдомицелиемРис. 11. Этапы формирования биопленки C. albicans117На рис. 11 представлены этапы формирования биопленки дрожжевымигрибами Candida albicans, которые, на наш взгляд, отражают общиезакономерности, выявленные у бактерий.В эксперименте со штаммами дрожжевых грибов Candida albicansпосле адгезии на субстрате происходило образование ростовой трубки(11а), затем появлялись дочерние дрожжевые клетки — бластоспоры инитевидные элементы, окруженные экзополимерным матриксом, хорошоразличимым при большом увеличении (11б).Особенностью этого процесса у дрожжевых грибов (эукариотов), вотличие от бактерий (прокариотов), является активное формированиепсевдомицелия, который достаточно прочно связан с продуцируемымиполисахаридными компонентами матрикса (11в).В известных моделях для получения смешанных биопленок, особеннотребовательных к субстратам, и облигатно-анаэробных видов, которыебыли описаны R.
Peyyala и другими зарубежными исследователямирекомендован принцип «сэндвич»-техники [138, 139, 238, 345, 383, 384, 385,399]. На монослой эпителиальных клеток in vitro проводили посев такназываемых «ранних колонизаторов», в качестве которых использовалимикроаэрофильные стрептококки с высокими адгезивными свойствами —Streptococcus mitis или Streptococcus oralis. Затем к ним добавлялипредставителей «промежуточных колонизаторов» десны — фузобактерии— и далее — представителей пародонтопатогенных видов («сэндвич»).Для решения задачи создания смешанной биопленки мы предложилисочетание методики «сэндвич» на твердойподложке с созданиемискусственного тока жидкости в анаэробных условиях. Это позволяломоделироватьтакиеважнейшиеусловияформированияприродныхбиопленок, как влияние текучих сред и дефицит кислорода.
В связи с этиммы использовали специальное оборудование — орбитальные шейкерыинкубаторы, в которые помещали микроанаэростаты для выделенияанаэробных видов (рис. 12).118Для получения биопленок в аэробных условиях было достаточноиспользовать шейкер-термостат для триацетатных или пластиковых кассет,в которых далее выращивали биопленки (рис. 13).Рис. 12. Шейкер-инкубатор с установленным анаэростатом длякультивирования биопленок анаэробов в условиях текучей средыРис.
13. Шейкер-термостат с фиксированной пластиковой кассетой длякультивирования биопленок аэробов в условиях текучей среды119Рис. 14. Смоделированная сэндвич-биопленка на твердой акриловойподложке (S. sanguinis+F. nucleatum+P.gingivalis). СЭМ. Ув. 6000× разРис. 15. Смоделированная сэндвич-биопленка на твердой акриловойподложке (S. sanguinis+F. nucleatum+P.gingivalis). СЭМ. Ув. 12 000× раз120Для получения смешанной биопленки в анаэробных условиях в лункипластиковой полиакриловой кассеты (или триацетатной) помещали взвесь«раннего колонизатора» — Streptococcus sanguinis (10 9 КОЕ/мл), которуювыращивали в течение 24 ч в среде AC (c гемином и менадионом). Вкачестве«промежуточногоколонизатора»кнейдобавляливзвесьFusobacterium nucleatum (10 6 КОЕ/мл), после чего культивированиепродолжали еще в течение 48 ч.
На следующем этапе добавляли взвесьPorphyromonas gingivalis в максимально возможной концентрации (10 6 –10 9КОЕ/мл). Культивирование проводили до 5 суток в тех же условиях(анаэробиоз, шейкер, 37 о С).Полученные образцы биопленки на твердой подложке (полиакрилат,триацетат) использовали для СЭМ (см. главу 2). В результате проведенныхэкспериментов получена смешанная сэндвич-биопленка, представленнаяотносительнопослойнорасположеннымиStreptococcussanguinis,Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, которая исследовананами при различном увеличении СЭМ (рис.
14, 15).Данныемикроскопическогоисследования,свидетельствующиеоморфологической целостности и, соответственно, о жизнеспособностибактерий при длительном их нахождении на поверхности пластмасс всоставе биопленок, также были подтверждены культуральным методом.Посев соскоба с поверхности биопленок пластмасс показал наличиежизнеспособных бактерий в биопленках на протяжении 1–1,5 мес.Наблюдения, в зависимости от объема взятой питательной среды длякультивирования (рис. 16).121Рис.
16. Контрольный высев материала смоделированной биопленкина 5% кровяной гемин-агар. Видны пигментированные колонии P.gingivalis, непигментированные — F. nucleatum, S. sanguinisОдним из важнейших факторов реализации процесса адгезии, поданным представленного нами обзора литературы, является шероховатостьповерхности субстрата, на котором далее формируется биопленка.Учитывая, что различные ортопедические конструкции из пластмассиспользуютсяврачами-стоматологамидляизготовленияшин,удерживающих зубной ряд в процессе комплексного лечения пародонтита,а также для протезирования пациентов с дефектами зубного ряда, мысчитали необходимым изучить особенности шероховатости поверхности спомощью атомно-силовой микроскопии.1223.2.Сравнительноеизучениеповерхностиобразцовстоматологических полимерных материалов и первичной адгезии вэксперименте in vitroОсобенности поверхности исследуемых материалов (гомогенность,шероховатость поверхности) изучены с помощью сканирующего атомно силового микроскопа (типа «Aist-NT», Россия).Дляпараллельногоизученияпервичнойадгезиимикроорганизмов(специфического прилипания к поверхности конструкционного материала дляпоследующей колонизации и формирования биоплёнки) из исследуемогостоматологического материала — пластмассы типа «Полиметилметакрилат» —мы изготавливали пластины площадью 1 см2, которые подвергали различнымтипам обработки с последующей отмывкой в дистиллированной (стерильной)воде.
Перед постановкой теста первичной адгезии пластины облучали вультрафиолетовом спектре и помещали для хранения в стерильные чашки Петри.Для экспериментальной части работы мы использовали следующиеобразцы:1) обработанные фрезой без полировки (контроль);2) полированные в условиях зуботехнической лаборатории;3) полированные в кабинете врача-стоматолога.Сводныерезультатыпоизмерениюшероховатостиповерхностисравниваемых образцов исследуемого материала с применением атомно-силовоймикроскопии приведены в таблице 8. Параметры шероховатости определяли пополученным изображениям поверхностей, при размере поля микроскопии 50 × 50мкм.С помощью атомно-силовой микроскопии установлено, что полированныеобразцы имеют на порядок меньшую шероховатость, чем образцы послефрезеровки.Поверхностьвсехобразцовнеоднородна,ипараметрышероховатости поверхности на различных участках образца могут сильноотличаться, что отражается в измеренном стандартном отклонении.123На образцах после фрезеровки имеются неровности с определеннымнаправлением, которое задается алгоритмом обработки образца и формой рабочейчасти фрезы.
На полированных образцах на поверхности имеются неровности ввиде выступающих частиц, которые могут быть связаны с плохим отводомпродуктов износа при полировке или прилипанием частиц полировочной смеси кобразцу. Наличие данных частиц приводит к увеличению разницы междусреднеарифметической и среднеквадратичной шероховатостью.Таблица 8Параметры шероховатости поверхности образцов полиметилметакрилата сразными способами обработки (полировки)ОбычнаяПолировка вПолировка вфрезеровказуботехническойстоматологическом(контроль)лабораториикабинетеRa, нм1270 ± 82076 ± 47*110 ± 64*Rms, нм1480 ± 880125 ± 70*166 ± 88*Rz, нм3830 ± 1140920 ± 380*990 ± 600*ПараметрыПримечания:В таблице указаны средние значения и после символа «±» — стандартное отклонение дляданного значения.* Различия достоверно ниже, чем в столбце «Контроль» (P < 0,05);достоверных различий между группами с полировкой нет.Более детальное изучение образцов при атомно-силовой микрокопии (АСМ)показало, что в образцах с «обычной» фрезеровкой (рис.
17, 18) имеютсяглубокие канавки глубиной порядка 10 мкм и шагом около сотни микрометров.Поверхность канавки на дне и на склоне имеет микрорельеф с невысокойшероховатостью. Микрорельеф состоит из неровностей, которые имеют то женаправление, что и канавка. Вероятно, данные неровности отражают формуфрезы, использованной для данного образца.124Рис. 17. Двумерное и соответствующее трехмерное представление рельефаповерхности образца после фрезеровки «обычной». Крайне высокийуровень шероховатости виден по оси ординат при шкале до 8 мкм.
АСМизображение125Рис. 18. Профиль сечения рельефа поверхности образца после фрезеровки«обычной». Параметры шероховатости: Ra = 1270 ± 820 нм, Rms = 1480 ±880 нм, Rz = 3830 ± 1140 нмВероятно, дополнительная финишная обработка (очистка) поверхностиможет значительно уменьшить измеряемую шероховатость образцов за счетудаления выступов, представляющих собой одиночные частицы или ихагломераты. Очевидно, что все эти факторы могут влиять на уровень первичнойадгезии микроорганизмов при их контакте с данным видом базисного полимера(пластмассы)ипоследующееформированиемикробнойбиоплёнкивклинических условиях и ее «агрессивность» для слизистой оболочки полости ртаи пародонта.Полученные нами цифровые данные, характеризующие первичнуюадгезию представителей пародонтопатогенной микрофлоры полости рта идрожжевых грибов к образцам стоматологического материала с разными типамиполировки, представлены в таблице 9.Как видно из представленных данных, для базисного стоматологическогоматериала «Полиметилметакрилат» отмечались принципиальные различияпервичной адгезии бактериальной (Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium126nucleatum, Streptococcus sanguis) и грибковой (Candida albicans) микрофлоры, втом числе и в зависимости от способа полировки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
