Диссертация (1139576), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Супернатант удаляли. Последобавления к осадку (осажденным клеткам) 2,0 мл фосфатно-солевого буферапроводили отмывание клеточной взвеси центрифугированием дважды, послечего лейкоциты ресуспендировали и добавляли 0,5 мл фиксирующего буфераFACS CellFix (BD Bioscience).Полученные пробы использовали для исследования на проточномцитометре FACSCanto 2, определяя экспрессию TLR2 и TLR4 на основныхсубпопуляцияхТ-лимфоцитов(CD3+-Лф),В-лимфоцитов(CD19+-Лф),моноцитах (CD14+-Мн) и гранулоцитах (CD45 dim-Нф).2.17. Статистические методы и критерииВ исследовании были использованы следующие статистические методы икритерии.2.17.1. Диаграмма квантилей (Q-Q plot), позволяющая провестивизуальную проверку нормальности распределения для всех наблюдений [46].Соответственно наблюдениям можно построить диаграмму, на которой абсциссаi-й точки равна i-й порядковой статистике, ордината i-й точки ― значению в i/nобратной функции стандартного нормального закона (n ― размер выборки).
Вслучае верности предположения о нормальности функции все точки должныхорошо укладываться в виде прямой линии.1082.17.2. Критерий Манна — Уитни позволял проверить однородностьдвух групп наблюдений и определить сумму рангов (порядковых номеров)наблюдений второй группы по отношению к первой в вариационном ряду [88].Как метод непараметрической статистики (альтернатива параметрическомукритериюtСтьюдента)использовалсянами,когданевыполнялосьпредположение о нормальности распределения.2.17.3.
Критерий хи-квадрат использовали при проверке независимостипризнаков путем построения таблицы сопряженности признаков [46].2.17.4. Двусторонний критерий Фишера использовали в тех случаях,когда в группе сравнения оказалось менее 5 наблюдений [88].2.17.5. Величину относительного риска (RR) применяли для выявленияналичия ассоциаций (взаимосвязей) исследуемых факторов с клиническимипризнаками. При этом вычисляли для него 95%-ный доверительный интервал(ДИ) и осуществляли проверку достоверности (р) отличия RR с использованиемточного двустороннего теста Фишера для четырехпольных таблиц с поправкойна количество выявленных вариаций (pcor) по методу Бонферони [127].Все расчеты проводили с помощью пакетов SPSS v15 for Windows иSTATISTICA 7.0. В таблицах и рисунках, представленных в нашей работе,значения N соответствует количество пациентов в группах сравнения, n —частота (встречаемости), % — относительная частота (доля от общегоколичества выборки), df — число степеней свободы, р — вероятностьсправедливости нулевой гипотезы, *, **, # — статистически достоверныеотличия между сравниваемыми группами.109ГЛАВА 3.ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОБНОЙ БИОПЛЕНКИ ВЭКСПЕРИМЕНТЕ И КЛИНИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ3.1.
Экспериментальная модель формирования микробной биопленкиin vitroДинамика процесса взаимодействия микроорганизмов с полимернымиматериалами была изучена с помощью метода сканирующей электронноймикроскопии (СЭМ) на моделях тест-штаммов грамположительных(Staphylococcus aureus) и грамотрицательных бактерий (Pseudomonasaeruginosae) по описанной выше методике (глава 2). Для оценкиморфофункционального состояния бактерий, длительно находившихся наповерхностиискусственныхматериалов,такжебылопроведеноультраструктурное исследование соскобов биопленки с использованиемпросвечивающего электронного микроскопа JEM 100В (JEOL Japan).В результате проведенного исследования для всех изученныхобразцов были установлены общие закономерности взаимодействиямикроорганизмов с поверхностью пластмасс и процессы, связанные сформированием очагов бактериальной персистенции в искусственныхматериалах.Поэтапно процесс взаимодействия микроорганизмов с поверхностьюакриловых пластмасс может быть представлен следующим образом.Первый этап — образование безмикробной пленки.
На сканограммахобразование безмикробной пленки соответствует появлению участковболее высокой электронной плотности (рис. 5а, 5б). Данный этап являетсячрезвычайно важным для последующей успешной адгезии бактерий кпластмассам.Безмикробнаяпленка,состоящаяизпродуктовжизнедеятельности микроорганизмов и компонентов питательной среды,меняет заряд поверхности с отрицательного на положительный, тем самым110обеспечиваяотрицательнозаряженнымбактериямприкреплениекповерхности за счет сил электростатического взаимодействия [279].баРис. 5. Образование безмикробной пленки (а), ячеистое строениебезмикробной пленки при большем увеличении (б) 24 часа инкубацииВторой этап — адгезия одиночных бактерий к поверхности (рис.
6а,10а). Наиболее интенсивно бактерии адгезируются в области дефектов,образовавшихся при механической обработке материала. На ранних срокахинкубации (24 час) синегнойная палочка, у которой хорошо развитжгутиковыйаппарат.адгезируетсялучше,чембезжгутиковыйстафилококк (рис. 6б, 10б).Жгутикисостоятизсократительныхбелков-флагеллинов,включающих спиральные нити толщиной 10–20 нм, крючок и базальноетело, что в совокупности обозначают как жгутиковый мотор, которыйобеспечивает движение бактерий к источнику питания, на поверхностикоторого могут быть особые химические соединения — аттрактанты [194].Перитрихиальные жгутики осуществляют поступательное движение и«роение» клеток, а полярные могут обеспечивать и движение бактерий поповерхности[1].Убезжгутиковыхбактерийреализацияадгезиипроисходит посредством увеличения экспрессии поверхностных адгезинов111(белок Вар и экзополисахариды (PIA или PNAG), которые обеспечиваютадгезию к субстрату и последующие взаимодействия между клетками[255,309].На третьем этапе происходит образование микроколоний (деление иобъединение бактериальных клеток в единую структуру).
На этом этапеможно было видеть начало синтеза экзоклеточного матрикса, которыйобъединяет бактерии и является облигатным признаком формированиябиопленки (рис. 7а, 10в).Четвертый этап — формирование зрелых биопленок с массивнымэкзоклеточным матриксом (рис. 7б, 8а, 8б, 10в).Экзоклеточныйматрикс,какправило,представленгомо-игетерополисахаридами, уроновыми кислотами, аминосахарами и ихсополимерами, белками, нуклеиновыми кислотами, липополисахаридами,различными минералами (кальций, фосфор и в микродозах — магний,калий и натрий). Он выполняет защитную функцию и участвует вформированиисмешанныхбиопленок,одновременнопрепятствуядиффузии бактерицидных агентов и действию различных повреждающихфизических факторов, таких как облучение ультрафиолетовым спектром,изменение pH, осмотическое давление, температурный режим, высыхание[53, 183, 229, 264, 440].Как видно на представленной фотографии, полученной с помощьюСЭМ, от зрелых биопленок отшнуровывались особые структуры —номады, состоящие из бактерий, окруженных матриксом (рис.
7а). Кроменомад, на поверхности биопленок были видны бактерии с четкимиконтурами без покрытия массивным экзоклеточным матриксом. (рис. 7б).Очевидно,чтономадыиповерхностнолокализованныебактерииобеспечивают популяции распространение в окружающей среде.При длительной инкубации (1,5 и 3 мес.) синегнойная палочка изолотистыйстафилококкнаходилисьнаповерхностиполимерныхпластмасс в массивных биопленках. Биопленки могли фрагментарно112отслаиваться от поверхности и растрескиваться, при этом внутрибиопленки визуализировались морфологически сохранные бактерии (рис.8а, 8б).
Возможно, растрескивание биопленки, так же как и номады,обеспечивает выход из нее жизнеспособных бактерий.При длительной колонизации бактериями поверхности изученныхполимеровповерхностипроисходитиформированиеувеличениеобъемадополнительныхранеедефектовсуществовавших.Биодеструктивные изменения в пластмассах возникают в результатедействия бактериальных эстераз (ферментов, расщепляющих эфирныесвязи полимеров) и продуктов их жизнедеятельности, в частностиорганических кислот [72, 269].По-видимому, в дефектах пластмасс бактериальные биопленкиспособны к длительному сохранению, поскольку надежно защи щены отагрессивного воздействия внешней среды (механического удаления,воздействия антибактериальных препаратов). В связи с этим можнообоснованно утверждать, что образованные на полимерных материалахбиопленки обеспечивают длительную персистенцию патогенных длячеловека возбудителей, потенциально являясь очагами хроническойинфекции.
Следует отметить, что в реальной клинической ситуацииналичие биопленок в полости рта, в состав которых может входитьпатогеннаямикрофлора,создаетугрозуразвитиявоспалительныхпроцессов не только локального порядка, но и для всего организма в целом.Это связано с возможной миграцией защищенных экзополиматриксомжизнеспособных бактерий в желудочно-кишечный и дыхательный трактыпри глотании и вдыхании, а также диссеминации гематогенным илимфогенным путем.Анализ ультратонких срезов соскобов с поверхности пластмасспоказал, что на ранних сроках инкубации до 14 суток в препарате былипредставлены в основном бактерии с сохраненной структурой, типичнойдля вегетативных форм бактерий, и незначительное количество форм113бактерий с дефектной клеточной стенкой (ДКС).
С увеличением сроковинкубации в препаратах соотношение форм бактерий смещалось в сторонуувеличения форм с ДКС, но сохранялись и бактерии в типичнойвегетативной форме с признаками деления.Наосновеэтихданныхможнозаключить,чтобактериивформирующихся биопленках сохраняют жизнеспособные клетки, как ввегетативной форме, так и в формах с ДКС, способных к реверсии втипичные вегетативные формы.Следует отметить и наличие лизированных бактерий в биопленках (рис9а, 9б).По существующим представлениям наличие лизированных бактерий вбиопленке может быть результатом так называемого каннибализма илиаутофагии. Аутофагические модели были описаны на молекулярном уровнеу многих бактерий при нехватке питательных веществ в среде обитания.Некоторые бактерии в колонии начинают выделять в окружающую средутоксины, направленные на уничтожение тех бактерий в той же популяции,которые не производят антитоксины [227].Продукция бактериями токсинов и антитоксинов рассматривается какфактор их персистенции в стрессовых для бактериальной популяцииусловиях [131].Данныеэлектронно-микроскопическогоcвидетельствующиесоответственнооморфофункциональнойжизнеспособностибактерийприисследования,сохранностиидлительномихнахождении на поверхности пластмасс в составе биопленок, былиподтверждены бактериологически.
Посев соскоба с поверхности биопленокпластмасс спустя 1.5 и 3 мес. инкубации показал наличие жизнеспособныхбактерий в биопленках, образовывавших колонии.114абРис. 6. Адгезия стафилококка и образование микроколонийчерез 24 часа (а) и 48 часов инкубации (б)абРис. 7. Начало синтеза экзоклеточного матрикса↑ (а),зрелая биопленка с номадами ↑ (б)115абРис. 8. Биопленка на поверхности пластмассы, 3 мес инкубации (а)Растрескивание биопленки ↑, бактерии на поверхности (б)абРис. 9. Ультратонкие срезы: S. aureus (a), P. aeruginosa (б) — вегетативныеклетки , детрит ↑ 3 мес.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
