Диссертация (1139576), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Методы бактериологического исследования2.6.1. Взятие материала для исследованияМатериал забирали из десневой борозды или пародонтального кармананатощак, перед утренней чисткой зубов. В предшествующий период (2 месяца)исключалосьприменениекаких-либоантибактериальных90химиотерапевтическихпрепаратовилиантисептическихполосканий,ирригаторов. Для взятия материала использовали стандартный стерильныйбумажный эндодонтический штифт (файл № 30), который помещали в десневуюборозду или карман на 30 сек для сорбции жидкой части, а затем переносили впробирку типа Eppendorff с 0,5 мл полужидкой транспортной среды Эймса илиСтюарта.
Транспортировку проводили в специальных термоконтейнерах притемпературе не выше –4 оС в течение 12 часов (как правило, 3–4 часа).2.6.2. Выделение чистых культур и их идентификацияДля количественного 4-секторного посева использовали методику поМельникову — Царёву на 5%-ном кровяном гемин-агаре (5 мкг/мл гемина, 0,1мкг/мл менадиона). Посевы в обязательном порядке помещали в анаэростаты(Himedia), заполняемые бескислородной газовой смесью стандартного состава(80% — азот, 10% — углекислый газ, 10% — водород). Редукцию остаточногокислорода осуществляли предварительно прогретым в сухожаровом шкафу (180оС, 60 мин) палладиевым катализатором. Последующий подсчет колоний послестандартного культивирования (в течение 7 суток при 37 оС) проводилибинокулярнымисследовательскимстереомикроскопом(Nicon,Япония).Микробное число (результаты количественного исследования) выражали черезколониеобразующие единицы — КОЕ/мл, или их десятичный логарифм.Припроведениикультуральногоидентификациивыделенныхобщепринятымиправиламиисследованиячистыхклиническойкультурипоследующейруководствовалисьанаэробноймикробиологии,используя принятые алгоритмы [94, 101, 204].Для идентификацииморфологических,выделенных культуркультуральных,использовали комплексбиохимических,хемотаксономическихпризнаков, а при необходимости — ПЦР и РНК-профиль.
Определение видовойпринадлежности чистых культур анаэробных бактерий, микроаэрофильныхстрептококков и грамотрицательных бактерий на основе оценки биохимических91свойств проводили также с использованием диагностических наборов АРI(Франция) и Roche (Германия).2.6.3. Определение чувствительности к антибактериальным препаратамДля контроля фенотипа чувствительности к антибактериальным препаратамиспользовали традиционный диско-диффузионный метод Кирби — Бауэра, дляопределения минимальной подавляющей концентрации (МПК) исследуемыхпрепаратов — кассетный микрометод [89]. Собственную модификацию данногометода применяли для определения чувствительности к антибиотикамоднородных и смешанных биопленок в условиях текучих сред.Проведение исследования для определения чувствительного фенотипаосуществляли по стандартному протоколу диско-диффузионного метода.Выполняли посев исследуемой культуры «газоном» при концентрации взвеси постандарту мутности MacFarland 108 КОЕ/мл.
Использовали стандартный агар дляопределения чувствительности фирмы Himedia Labs (Индия), для анаэробныхбактерий— с 5% крови и 10 мг/л гемина. Затем на поверхность посеванакладывали стандартные диски с антибиотиками, используя автоматическийдиспенсер фирмы Himedia Labs (Индия) и пластиковые чашки диаметром 90 и100 мм. Учет результатов проводили после инкубации в термостате при 37 оС 24час (для анаэробов — в анаэростате до 7 суток).
Для быстрого учета результатови документирования полученных данных использовали автоматический счетчикколоний Scan 500 (Interscience) с компьютерным сопровождением регистрацииданных.При использовании диско-диффузионного и кассетного микрометодов длярегистрации данных применяли также исследовательский стереомикроскоп(Nikon).922.7. Изучение первичной микробной адгезии in vitroМоделирование процесса первичной адгезии микроорганизмов к образцамполимеров и сплавов, используемых в стоматологии (для шинирования зубныхрядов),проводилисоштаммамимикробов,относящихсякпародонтопатогенным видам, которые были выделены из пародонтальныхкарманов у больных пародонтитом: Porphyromonas gingivalis, Fusobacteriumnucleatum, Streptococcus sanguinis, а также дрожжевых грибов Candida albicans.Указанные исследования выполнялись нами в бактериологическойлаборатории кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ им.А.
И. Евдокимова (разрешение главного государственного санитарного врача №77.01.16.000. М.015177.11.09, г. Москва от 18.11.2009).Идентификацию выделенных штаммов проводили с использованиемпротокола, рекомендованного для анаэробной бактериологической лабораториис применением тест-систем API 20 A и API 20 Strep фирмы «БиоМерье»(Франция), а также по генетическим маркерам с помощью полимеразной цепнойреакции [59, 102].Для проведения методики оценки первичной адгезии идентичныеисследуемые образцы стоматологических материалов размером 1 × 1 смпомещали в чашку Петри; затем на поверхность наносили 100 мкл взвесисуточной культуры микроорганизмов тест-штаммов (рис.
2). Исходная густотавзвеси бактерий составляла 108 КОЕ/мл (0,5 ЕД по стандарту мутностиMcFarland); грибов — 106 КОЕ/мл. Далее алгоритм действий соответствовал п.2.6.2.Процедура постановки эксперимента соответствовала стандартномупротоколу [23, 48, 66] с незначительными модификациями, которые заключалисьв следующем. Для удаления не прилипших бактерий или дрожжей вначалеобразцы трижды отмывали в 10 мл стерильного изотонического растворахлорида натрия.
Затем каждый образец помещали в отдельную пластиковуюкамеру, содержащую 1 мл стерильной питательной среды АС. Далее93пластиковые камеры с исследуемыми образцами обрабатывали ультразвуком вультразвуковой ванне Ultrа-Est-M (НПФ «Геософт», Россия) при частоте 60 кГцв течение 10 мин, что позволяло «снять» и перевести во взвешенное состояниете микробные клетки, которые вступили в первичную адгезию с поверхностьюстоматологического материала (рис. 3).Рис. 2.
Нанесение взвеси тест-культуры на образцы стоматологическойпластмассы для шинирования зубных рядовРис. 3. Обработка образца стоматологической пластмассы с тесткультурой в ультразвуковой ванночке UltraEst-M («Геософт», РФ)94Затем из полученного смыва с образцов с помощью автоматическоймикропипетки проводили посев 100 мкл на 5%-ный кровяной гемин-агар наоснове Columbia. Распределение материала проводили по поверхностипитательной среды с помощью стерильной платиновой петли. Для исследованияадгезии дрожжевых грибов использовали плотную среду Сабуро.Полученныеколонииподсчитывалииизучалиспомощьюисследовательского стереомикроскопа (Nikon, Япония) и на основанииопределения десятичного логарифма рассчитывали индекс первичной адгезиидля каждого образца материала/тест-штамма по формуле, предложенной В. Н.Царёвым [23]:Ia= IgA/IgN,где Ia — индекс первичной адгезии; A — количество бактерий, прилипшихк образцу; N — количество бактерий в смыве с образца.2.8.
Модель формирования микробной биопленки in vitroДля формирования однородной (моно-) биопленки использовалитрадиционную методику моделирования биопленки на твердой подложкеиз акриловой пластмассы в прогрессивно истощающейся среде [309, 310]в нашей модификации, разработанной совместно с Л. В. Диденко в 2015 г.[25].Динамика процесса взаимодействия микроорганизмов с полимернымиматериалами была изучена с помощью метода сканирующей электронноймикроскопии (СЭМ). Образцы полимеров (пластины размером 1 × 1 см)помещали в питательный LB-бульон (Luria-Bertani broth), в которыйпредварительно засевали культуру бактерий в концентрации 10 6 /мл.Инкубацию образцов проводили при температуре 37 °С в течение 1, 2, 7 и14 суток, а также в более отдаленные сроки — через 1,5 и 3 месяца.
Приинкубации образцов дополнительного внесения питательной среды не95производили, и таким образом стимулировали процесс образованиябиопленки в прогрессивно истощающейся среде [310].Для формирования смешанных биопленок, особенно требовательныхк субстратам, и облигатно-анаэробных видов микробов мы использовалимодификацию методики, впервые предложенной R. Peyyala в 2011 — 2013гг. [383, 384, 385], согласно которой предлагается культивироватьпародонтопатогенные виды на монослое эпителиальных клеток in vitro,которые предварительно колонизировалиоральными стрептококками(Streptococcus mitis).
Затем к ним добавляли взвесь представителейпромежуточных колонизаторов десны — фузобактерий и далее —пародонтопатогенные виды («сэндвич»). В литературе описано получениебиопленок с использованием «сэндвич»-техники для 5–7 и даже 10 видовмикробов [138, 139, 238, 345, 383, 399].МымоделировалиStreptococcussanguinisтрехкомпонентнуюinvitro+Fusobacteriumбиопленкуnucleatum/periodonticum—+Porphyromonas gingivalis. Учитывая, что биопленки в естественныхусловиях (природных биоценозов и в организме) образуются в условияхтекучих сред, а микроорганизмы пародонтопатогенной группы являютсяанаэробами, мы поставили своей задачей воспроизведение движенияжидкой питательной среды при одновременном создании анаэробныхусловий,чтопотребовалоиспользованияспециальнойтехникикультивирования (см.
гл. 3).2.9. Экспериментальная модельпародонтита in vivo на лабораторных животных (крысах)Для проведения исследования мы использовали модель лигатурногопародонтита у крыс, которых после развития воспалительного процесса в деснепоиливзвесьюэубиотическихштаммоввейллонеллистрептококков.Эксперименты проведены на 18 крысах Вистар (самцы) весом 220–250 граммов.96У всех животных под гексеналовым наркозом воспроизводили пародонтит путемввязывания шелковой лигатуры в области шейки нижних резцов [18]. Через 14дней, когда в области пародонта развился воспалительный процесс, лигатуруудаляли и крыс разделили на 2 группы: контрольную и опытную.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
