Диссертация (1139576), страница 18
Текст из файла (страница 18)
В контрольнойгруппе животные получали обычную водопроводную воду. В опытной группе вводу добавляли эубиотическую микрофлору анаэробно-микроарофильнойгруппы — смесь референтных штаммов Veillonella parvula + Streptococcussalivarius (V+S). Густота взвеси обоих видов бактерий для колонизациисоставляла 108 КОЕ/мл в питательной среде АС (Oxoid).В обеих группах исследовали микробную колонизацию слизистой оболочкидесны для выяснения возможности колонизации, а также ее продолжительностипосле завершения приёма эубиотической взвеси V+S.Крыс, взятых в эксперимент, обследовали бактериологическим методом сиспользованием техники анаэробного культивирования. Материал забирали иззоны предполагаемого наложения лигатуры (фоновые данные) в транспортнуюсреду Стюарта, доставляли в лабораторию и выполняли количественный посевпо Гольду на 5% кровяной агар с гемином. Чашки Петри с посевамиинкубировали в анаэростате 7 суток при 37 оС.
До и после снятия лигатуры на10-е и 20-е сутки у крыс обеих групп проводили исследование состава основныхпредставителей микрофлоры в гнойном содержимом из очага воспаления сиспользованиембактериологическогометодаитехникианаэробногокультивирования.2.10. Прямое белковое профилирование штаммов анаэробных бактерий спомощью масс-спектрометрии 16S-рибосомальных белковДляпроведениямасс-спектрометрическогоанализаиспользовалиионизационную пролетную MALDI-TOF спектрометрию на масс-спектрометреMicroflex (Bruker Daltonics, Германия). Метод использован для подтвержденияидентичности кандидатных пробиотических штаммов Veillonella parvula и97Streptococcus salivarius в эксперименте.Припроведенииисследованийиспользовалипараметрыработыаппаратуры: линейный режим, частота импульсов — 10 Гц, детекцияположительно заряженных ионов при ускоряющем напряжении — 20 кВ, снапряжением накапливающего электрода — 18,6 кВ, время задержки экстракции— 350 нсек.Для получения результата каждый из образцов вносили в три ячейкипланшета и регистрировали конечный спектр (500 имп.
лазера), которыйполучали при суммировании 10 одиночных спектров по 50 имп. лазера. Длявнешней калибровки использовали точные значения масс известных белков E.coli DH5@. Анализ полученных спектров проводился автоматически впрограмме flexAnalysis 2.4 (Bruker Daltonics, Германия).2.11. Определение генетических маркеров пародонтопатогенных бактерийи грибов кандида с помощью мультиплексной ПЦРМетодика проведения полимеразной цепной реакции соответствоваламедицинской технологии ФС № 2006/043-У, утвержденной федеральнойслужбой «Росздравнадзор», которая включает следующие основные этапы.2.11.1. Взятие образцов материала для ПЦРПеред взятием материала у пациента наддесневые отложения (зубнойналет) удаляли с помощью стерильных кюреток, а место отбора образцаосушали стерильным ватным шариком.Для взятия материала использовали стандартный стерильный бумажныйэндодонтический штифт (файл № 30), который помещали на 30 сек. в десневуюборозду или в наиболее глубокий участок ПК таким образом, чтобы былисключен контакт со слизистой оболочкой, поверхностью корня или коронкизуба.
Далее штифт с сорбированным материалом вносили в 0,5 млизотонического раствора хлорида натрия в стерильной пластиковой пробирке98типа Eppendorff, Перемешивали содержимое пробирки, удаляли зонд [59].Транспортировку проводили в специальных термоконтейнерах притемпературе не выше –4 оС в течение 12 ч (как правило, 3–4 ч).2.11.2. Выделение ДНКДля выделения ДНК использовали ускоренную пробоподготовку снабором реагентов НПФ «Генлаб» (РФ) согласно инструкции производителя.2.11.3. Амплификация ДНКПри проведении ПЦР использовали две системы: «МультиДент-5»(«ГенЛаб», Россия), которая позволяет выявить генетические маркеры трехпародонтопатогенныхвидов1-гопорядка(Aggregatibacteractinomycetemcomitans, Tannerlla forsythia, Porphyromonas gingivalis), и двух —2-го порядка (Prevotella intermedia, Treponema denticola) и МicroIDent+ (6 видов2-гопорядка,включаяEikenellacorrodens,Fusobacteriumnucleatum/periodonticum, Parvimonas micra, Capnocytophaga spp., Campylobacterrectus, Eubacterium nodatum).ДляпроведенияПЦРисходнуюДНК-полимеразуразводилисоответствующим буфером до конечной активности 1 ед/мкл и аккуратноперемешивали пипетированием.
В полипропиленовые пробирки емкостью 500мкл помещали реакционную смесь — по 19 мкл и разведенную ДНК-полимеразу— по 1 мкл. Чтобы предотвратить испарение реакционной смеси, на пробыосторожно наслаивали вазелиновое масло в количестве 25 мкл.В пробирку с отрицательным контролем (маркировка ОК) помещали 5 мклОК (под масло).
В пробирку с положительным контролем (маркировка ПК)помещали 5 мкл ПК (под масло). В остальные пробирки (№ 1, 2, 3 …) помещалиДНК, выделенную из исследуемого материала по 5 мкл (под масло).Пробирки с пробами размещали в программируемом термостате(амплификатор «Терцик МС-2», производитель «ДНК-технология», г. Москва),99который был предварительно прогрет до температуры +95 0С, и далее проводилиамплификацию при стандартном режиме «Матрица»: денатурацию осуществляли при +95 0С в течение 120 сек, 1 цикл; далее денатурацию осуществляли при +95 0С в течение 30 сек, отжигпроводился при +60 0С в течение 30 сек, синтез — при +72 0С втечение 40 сек, 33 цикла; синтез на конечной стадии проводили при +72 0С в течение 240 сек,1 цикл.2.11.4.
Детекция продуктов амплификацииДлядетекцииклонированныхобразцовДНКиспользовалигель-электрофорез в 1,6% агарозном геле при окрашивании этидием бромидом(Комплект для анализа продуктов ПЦР, НПФ «ГенЛаб»).Для приготовления буфера для электрофореза содержимое пакета снавеской буфера для электрофореза переносили в коническую колбу и добавляли2000 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивали до полногорастворения порошка.
Приготовление агарозного геля проводили следующимобразом: в термостойкую колбу добавляли 100 мл буфера для электрофореза ивносили содержимое одного пакета с агарозой (1,6 г). Расплавляли агарозу принагревании на электрической плитке, добавляли 5 мкл этидиума бромида,осторожно перемешивали содержимое колбы равномерными вращательнымидвижениями. Расплавленную агарозу охлаждали при комнатной температурепримерно до температуры +65 0С. Устанавливали гребенку на платформу длязаливки гелей и заливали расплавленную агарозу в платформу так, чтобытолщина геля составляла примерно 4 мм.
После застывания агарозы заливалиповерхность геля буфером для электрофореза, осторожно вынимали гребенку,платформу с гелем переносили из ванночки в электрофоретическую камеру изаполняли ее буфером для электрофореза. В соответствующие лунки агарозногогеля под буферный раствор вносили по 14 мкл амплифицированных образцов ипроводили электрофорез при напряжении 120 V в течение 25–30 мин.100Электрофорез прекращали после того, как краска для электрофореза голубогоцвета (ксиленцианол) отходила от старта не менее чем на 2 см, а краска желтогоцвета (оранж G) — не менее чем на 7 см.Дляпросмотраифотографированиягелейиспользовалиультрафиолетовый трансиллюминатор ТСР-25 М (Vilber Lourmat, Франция) сдлиной волны 312 нм. В положительном контрольном образце определялось 5светящихся полос розового цвета, размером 1000 п.
н., 745 п. н., 512 п. н., 360 п.н., 197 п. н., соответственно фрагментам геномов Prevotella intermedia, Tannerellaforsythia,Treponemadenticola,AggregatibacteractinomycetemcomitansиPorphyromonas gingivalis; в отрицательном контрольном образце эти полосыотсутствовали. В исследуемых образцах при положительном результате ПЦРопределялосьотоднойдопятисветящихсяполос,расположенныхсоответственно размеру генома на том же уровне, что и полосы в положительномконтроле.2.11.5 Обратная гибридизация ДНКПри определении пародонтопатогенов 2-го порядка использовалиметодику обратной гибридизации ДНК с помощью коммерческой системыМicro-IDent®plus (Hain Diagnostika, Германия).
Перед проведением реакциинагревали встряхиваемую водяную баню и растворы реагентов 2 и 3 до 45 оС, всеостальные растворы (кроме конъюгата) — до комнатной температуры.После проведения реакции проявление цвета останавливали с помощьюополаскиванияполосок,накоторыхосуществлялиреакцию,бидистиллированной водой. После высушивания полосок на бумажномполотенце считывали результаты, пользуясь специальной картой считывания.Хранение проявленных полосок осуществляли в темноте.Регистрацию результатов осуществляли следующим образом. Маркернуюлинию, расположенную на нижнем конце полоски, совмещали с черной линиейв выемке карты считывания (рис. 4).101Рис.
4. Шаблон и результаты реакции обратной гибридизацииОбозначения: Pm — P. micros, Fn — F. nucleatum / periodonticum, Cr — C. rectus,En — E. nodatum, Ec — E. corrodens,C. sp. — Capnocytophaga spp. (S.gingivalis, C.ochracea, C.sputigena).На каждой полоске присутствуют несколько реакционных зон, включая:контроль конъюгата (СС) ‒ для подтверждения эффективности связыванияконъюгата и реакции с субстратом (эта зона должна быть окрашена) иуниверсальный контроль (АС) ‒ эта зона показывает, была ли ДНК очищена иамплифицирована.2.12.
Определение генетических маркеров резистентности кантибиотикам с помощью ПЦР2.12.1. Взятие исследуемого материала и выделение ДНК проводилианалогично п. 2.11.1. или непосредственно из колоний микроорганизмов.2.12.2. Идентификация ДНК с помощью ПЦРВыявление устойчивости микробов к антибиотикам проводили с помощьюнаборов реактивов в комплентации OneStep производства НПФ «Литех» дляобнаружения генетически обусловленной устойчивости микроорганизмов кантибиотикам методом ПЦР.102В образцах из пародонтальных карманов проводили идентификацию геновхромосомных участков Мес, VanA, VanB, Clx-m, Erm, Tet. Гены плазмид Qnr Аи B определяли с помощью наборов реагентов НПФ «Генлаб» (Москва).ДНК из исследуемого материала выделяли с помощью реагента ДНКэкспресс НПФ «Литех» (Москва).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
