Диссертация (1139576), страница 19
Текст из файла (страница 19)
В пробирки с реактивом вносили по 100 мкланализируемого материала и тщательно перемешивали на вортексе в течение 10сек. Инкубировали пробирки в течение 20 мин в твердотельном термостате при98 0С. Центрифугировали при 12 000 g при комнатной температуре в течение 30сек. Супернатант использовали в качестве образца ДНК для постановкиамплификации.В пробирки с 20 мкл рабочей амплификационной смеси под слой маславносили по 5 мкл образца ДНК из обработанной анализируемой пробы. Впробирку для положительных контрольных образцов вносили по 5 мклположительного контрольного образца ДНК, а в пробирку с отрицательнымконтролем — разбавитель (5 мкл).Анализируемыепробыпомещаливпрогретыйтермоциклер(амплификатор «Терцик МС-2», производитель «ДНК-технология», г.
Москва) иосуществляли амплификацию по программам: 93°, пауза; 93°, 30 сек, 59°, 30 сек,72°, 30 сек (35 циклов) на наличие генов — маркеров резистентности кцефалоспоринам CTX-M или 94°, пауза; 94°, 1 мин 30 сек (1 цикл); 94°, 10 сек,64°, 10 сек, 72°, 40 сек (40 циклов); 72°, 2 мин (1 цикл) — к карбапенемам VIM,NDM, OXA-48; цефалоспоринам Mec A; ванкомицину и тейкопланину Van A иVan B.2.12.3. Детекция ДНК методом электрофорезаРазделениепродуктовамплификациипроводилиметодомгоризонтального электрофореза (в 2% агарозном геле).
Для просмотра ифотографирования гелей использовали трансиллюминатор ТСР-25 М (VilberLourmat, Франция) с длиной волны излучения 312 нм.103В случае положительного контроля и при наличии в пробе гена-маркерадолжно быть видно две светящиеся полосы (таблица 7).Таблица 7Перечень антибиотиков и размер генетическихпродуктов при амплификации ДНК (п. н.)Ген резистентностиРазмеры фрагментов, п. н.к антибиотику:ПоложительныйВнутреннийконтрольконтрольКарбапенемам VIM315788Карбапенемам NDM303788Карбапенемам OXA-48315788Цефалоспоринам CTX-M495220Цефалоспоринам MecA450788Гликопептидам: ванкомицину256788427788и тейкопланину VanAВанкомицину VanBВ отрицательном контрольном образце может присутствовать полосавнутреннего контроля, свидетельствующая о наличии в пробе ДНК.Для документирования полученных результатов гели фотографировали впроходящем ультрафиолетовом свете цифровой видеокамерой, соединенной скомпьютером(программноеобеспечениеGelImager,позволяющееанализировать видеоизображение).2.13.
Иммуноферментный анализ (твердофазный метод)2.13.1. Иммуноферментный анализ содержания антител к грибам родаCandida в сыворотке кровиИсследуемым материалом являлась сыворотка венозной крови пациентов.Использовали готовые тест-системы НПФ «ГенЛаб» (РФ), содержащие реагентыдля выявления IgM и IgG антител к Candida albicans, IgM и IgG антител к Candida104Krusei и IgG антител к родовому АГ дрожжевых грибов Candida.
Дляопределения оптической плотности использовали многоканальный фотометрMultiscan (США), длина волны 492 нм (регистрацию проводили не позднее 10мин с момента окончания реакции). Результаты исследований выражали виндексах иммуноферментной реакции (I, ЕД ИФА), рассчитываемых поформуле:I = (Еан/Ео) х 100%,где Еан — величина оптической плотности анализируемой сыворотки; Ео —величина оптической плотности сыворотки контрольного пула.2.13.2. Иммуноферментный анализ содержания интерлейкинов всыворотке крови и десневой жидкостиОпределение цитокинов в сыворотке крови (IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, TNFα, IL-17А и INF-γ) выполняли с использованием иммуноферментногоанализатора Stat Fax 3200 Readers (США).
Содержание IL-1β определялинабором реагентов А-8766 ИФА-БЕСТ, IL-6 — А-8767 ИФА-БЕСТ, IL-8 — А А8768 ИФА-БЕСТ и TNF-α — А-8756 альфа-ФНО-ИФА-БЕСТ (НПФ «ВекторБест», Россия). Количество IL-17А и INF-γ определяли с помощью наборареактивов HUMAN IL-17А (Hycult Bioteсh, Нидерланды)Известно, что провоспалительные цитокины являются продуктамиактивированных макрофагов и определяются в сыворотке крови здоровых людейв очень низких концентрациях и с невысокой частотой выявления. Так, поданным Л. В.
Ковальчука с соавт. [41], концентрация ИЛ-1β у 40% здоровых лицв среднем составляет около 12 пг/мл, а ФНО-α у 5% — 5 пг/мл.Концентрацию цитокинов в десневой жидкости или содержимомпародонтального кармана (IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-α, IL-17А и INF-γ)определяли аналогичным образом, используя набор реактивов HUMAN IL-17А(Hycult Bioteсh, Нидерланды) и наборы производства «Вектор-Бест» (Россия).105Десневую жидкость (экссудат пародонтального кармана) отбирали с помощьюбумажных эндодонтических штифтов стандартного размера (№ 30).
Объемдесневой жидкости определяли по разнице весов бумажного штифта до и послепропитывания по О. А. Ганковской [21].Приготовление образцовЭндодонтические бумажные штифты, пропитанные десневой жидкостью,помещали в стерильную пластиковую пробирку типа Eppendorf, содержащую 0,5мл физиологического раствора. Перемешивали на вортексе в течение 10 мин.Затем центрифугировали в течение 10 мин при 4оС при 1500 об./мин.Супернатант переносили в полипропиленовые пробирки. Выделенные образцыхранили при –20 оС или использовали в постановке реакции.
Перед постановкойреакции образцы выдерживали при комнатной температуре (18–25оС),аккуратно перемешивали, избегая пенообразования, и разводили в 2000 раз.Далее проводили постановку реакции по стандартной схеме. Для оценкирезультатов ИФА использовали иммуноферментный анализатора Stat Fax мод.3200 Readers (США), 450 нм. Регистрацию проводили в течение 30 минут послеостановки реакции.Для интерпретации результатов рассчитывали среднюю абсорбцию укаждого дупликата стандартов, контролей и образцов.
Допустимыми значениямиотклонения в параллелях считались не более чем на 15% от соответствующихсредних значений. В этом случае результат считали подозрительным и образецподвергали повторному исследованию.2.13.3. Иммуноферментный анализ содержания дефензинов HNP 1-3 всыворотке крови и десневой жидкостиДля определения HNP 1-3 в плазме периферической крови, выделенной излоктевой вены, и десневой жидкости, взятой в области зубодесневой бороздыили пародонтальных карманов зубов 16, 25, 36 и 45 с помощью бумажныхэндодонтических штифтов стандартного размера (№ 30), использовали106твердофазный метод ИФА с набором реагентов HUMAN HNP 1-3 (HycultBioteсh,Нидерланды).Дляопределенияобъемадесневойжидкостирассчитывали разницу веса бумажного штифта до и после сорбции жидкостидесневой борозды или экссудата пародонтального кармана (за 30 секунд).2.14.
Определение количества лейкоцитов периферической крови идесневой жидкостиДляколичественногоопределениялейкоцитовиопределениялейкоцитарной формулы использовали традиционную методику подсчета вкамере Горяева и мазке крови при окраске по Романовскому.2.15. Определение функциональной активности нейтрофиловОпределение функциональной активности лейкоцитов осуществляли впериферической крови и десневой жидкости, используя методику выделения«оронейтрофилов». Для оценки функциональной активности применялитрадиционныйметодфагоцитозалатекса,опсонизированногоиммуноглобулином IgG.2.16.
Иммунофенотипирование лейкоцитов и идентификация Tolllike-рецепторов на клетках десневой жидкостиВ качестве исследуемого материала брали десневую жидкость и смывы изпародонтального кармана с помощью изотонического раствора хлорида натрия.Для идентификации клеточных рецепторов CD282 (TLR-2) / СD284 (TLR-4)использовали соответствующие моноклональные АТ, меченные FITC.
Послефиксации параформальдегидом готовые препараты исследовали в микроскопеECLIPSE 50i (Nicon, Япония) с увеличением в 1000 раз. Документировалисвечение на цифровую камеру микроскопа.Дляопределенияфенотипалейкоцитовпериферическойкровииспользовали метод проточной лазерной цитофлуориметрии [84, 317].
Дляэтого в пробах смешивали 100 мкл венозной крови и 10 мкл АТ, меченных107флюоресцентными многоцветными красителями, против TLR2 (TLR2 IgG1 —FITC), CD14 — PE, CD45 — PerCP, CD19 — APC, CD3 — AF700 или TLR4(TLR4 IgG1 — FITC) и CD14 — PE, CD45 — PerCP, CD19 — APC, CD3 —AF700. В пробы с отрицательным контролем добавляли АТ мыши, меченныеFITC (IgG1 — FITC), а также АТ, меченные PE, PerCP, APC и AlexaFluor 700.Инкубировали 30 минут в темноте при температуре +4 оС. Для удаленияэритроцитов использовали лизирующий буфер FACSLyse (BDBioscience) вколичестве 2,0 мл (10 мин при комнатной температуре, в темноте). Затемпроводили центрифугирование (500 g, 5 мин).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
