Диссертация (1139516), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Также была найдена слабая обратная зависимость междуTLR4 и HBD-2.Намипроведеноизучениемикробиотыифакторовврожденногоиммунитета (TLR2, TLR4, HBD-1, HBD-2, TNFα и NF-kB) на уровне слизистыхоболочек верхних дыхательных путей при внутриутробном инфицировании плодаи пневмонии новорожденных.Показатели врожденного иммунитета – Toll подобные рецепторы (TLR2,TLR4) – экспрессировались на эпителиальных клетках верхних дыхательныхпутей как у новорожденных с ВУП, так и у детей с РНП. Следует отметить, что у259новорожденных с ВУП уровни экспрессии распознающих структур былидостоверно снижены в два раза, этот факт можно объяснить как генетическимиособенностями организма ребенка, так и активностью факторов патогенностимикроорганизмов.Для подтверждения последней гипотезы был проведен анализ ассоциациипоказателей врожденного иммунитета и наличием определенного возбудителя.Были выделены подгруппы детей с пневмониями, вызванными K.pneumonia,P.aeruginisa, E.coli, кокковой флорой и смешанной инфекцией.Показано, что экспрессия гена TLR2 снижалась в 6,2 раза у пациентов сK.pneumonia и в два раза и более при смешанной инфекции.
Уровни экспрессиигена TLR4 были снижены более чем в три раза при инфекции, вызванной E.coli.Кроме того, нами были также определены уровни экспрессии генов HBD-1и HBD-2 в эпителиальных клетках верхних дыхательных путей в группахноворожденных с ВУП, с РНП и у здоровых детей.Известно,чтодефенсиныинфекционных возбудителей.осуществляютзащитуслизистыхотHBD-1 постоянно вырабатывается на уровнеслизистой верхних дыхательных путей, а HBD-2 – индуцибельно, т.е.
поддействием инфекционных патогенов.Показано, что экспрессия гена HBD-2 увеличивается в 2,3 раза уноворожденных, у которых определяется инфекционный возбудитель, но приэтомотсутствуютклиническиепроявленияпневмонии.Такжепоказанодостоверное снижение показателя HBD-2 (в 3,2 раза) у пациентов с пневмонией,вызванной K. pneumonia.Помимодефенсинов,провоспалительногоцитокинабылTNFαпроведенианализфактораэкспресиитранскрипциигеновNF-kBвэпителиальных клетках верхних дыхательных путей в исследуемых группах.Данные молекулы участвуют в сигнальном пути с TLRs. Так, было показано, что удетей, у которых выявляли инфекционные возбудители, но не было клиническихпроявлений, показатель цитокина возрастал более чем в два раза.260Иммунологические показатели (распознающие структуры – TLR2, TLR4,дефенсины HBD-1, HBD-2, провоспалительный цитокин TNFα и фактортранскрипции NF-kB) у новорожденных с внутриутробным инфицированием и спневмонией изменяются неоднозначно.
Выявлена тенденция к снижениюэкспрессии генов TLR2, TLR4 и увеличению экспрессии генов TNFα и NF-kB.Данные изменения коррелируют с инфекционным возбудителем, следовательно,можно предположить, что непосредственно возбудитель за счет действияфакторов патогенности влияет на показатели врожденного иммунитета.Таким образом, было выявлено наличие ассоциации полиморфных аллелейв генах IL-10 (A(-1082)G) и TNF (G4682A) с инфекционной патологией плода иноворожденного.Впоследнеевремядоказанарольнаследственныхфактороввинтенсивности реализации механизмов врожденного иммунитета. Генетическаяпредрасположенность к развитию ВУП и РНП связана с наследованиемопределенных аллелей и генотипов.В данной работе мы выбрали ряд факторов врожденного иммунитета,которыеподаннымбиоинформационногоанализаипорезультатамэкспрессионного профиля имеют большое значение в защите организма принеонатальныхпневмониях.ВсеониявляютсякомпонентамиTLR-опосредованного пути.Полиморфный маркер, который мы исследовали в работе, локализуется внетранслируемой 5’-области гена DEFB1 (кодирующего белок -дефенсин-1человека).
И изменения его состояния могут напрямую влиять на количествоэкспрессируемого белка. Следовательно, можно говорить о генетическиопосредованной регуляции количества дефенсина на уровне слизистых оболочек.Также нами были исследованы полиморфизмы в генах как про-, так ипротивовоспалительных цитокинов. Во-первых, доказан факт участия цитокиновв защитных механизмах против возбудителей пневмонии. Во-вторых, выявленполиморфизм цитокиновых генов, как в области экзонов, кодирующих261функциональнуюобластьмолекулы,такивинтронах,влияющихнаэффективность экспрессии цитокина.Таким образом, активность и количество одного и того же цитокина могутбыть различными в зависимости от генетических вариаций.При изучении распределения аллелей и генотипов полиморфного маркераArg753Gln гена TLR2 среди родильниц, у которых родились дети с ВУП и РНП, атакже в группе родильниц с физиологически протекавшей беременностью и безпатологии плода обнаружено преобладание частоты аллеля Arg над частотойаллеля Gln, и встречаемость генотипа ArgArg над встречаемостью генотиповArgGln и GlnGln во всех исследуемых группах (у родильниц).
Отличияраспределения аллелей и генотипов между группами были недостоверны.В нашей работе также исследовалось распределение аллелей и генотиповполиморфного маркера Arg753Gln гена TLR2 у новорожденных с ВУП и РНП.Частота аллеля Arg была значительно выше аллеля Gln и варьировала в диапазоне0,86 - 0,95 (частота аллеля Gln варьировала в диапазоне 0,05 - 0,14). Следуетотметить, что частота гетерозиготного генотипа была выше, чем в аналогичнойгруппе родильниц. А генотип GlnGln отсутствовал в исследуемых нами группахноворожденных.Таким образом, можно заключить, что полиморфный маркер Arg753Glnгена TLR2 не связанпневмониейс внутриутробным инфицированием плода, а также сноворожденных.Можнопредположить,чтохотязаменааминокислоты в 753 положении могла привести к изменению передачи сигнала сTIR-домена TLR2 рецептора, но в наших исследованиях это изменение не былокритично для реализации патологии новорожденных.Другой,исследуемыйнамигенетическиймаркер, локализовалсявкодирующей области гена TLR4 и реализовался через замену аминокислоты Aspна Gly в 299 положении.Нами показано, что и у родильниц, и у новорожденных доминировал аллельAsp и генотип AspAsp как в группе сравнения, так и в опытных группах.
Быловыявлено, что у родильниц аллель Gly и генотип GlyGly ассоциированы с262развитием внутриутробного инфицирования плода. Частота аллеля Gly при этомсоставляет 0,11, а генотипа - 0.09, в группе сравнения частота аллеля - 0,02, агенотип не определяется. У новорожденных аллель (частота 0.08) ассоциирована свнутриутробной инфекцией, а также генотип AspGly (частота 0,17). При этом вгруппе сравнения данный маркер не определялся.Таким образом, в дагестанской популяции нами был определен маркер вгене TLR4, который ассоциирован с ВУП (как аллели, так и генотипы). Однако,анализируя результаты русской популяции (на территории г.
Москвы) можносказать, что данный маркер не имеет подобной ассоциации 24.Можно сделать заключение, что представленные маркеры могут бытьиспользованы сугубо на региональном уровне.Далее нами был проведен поиск других полиморфных маркеров в генахсигнальныхрецепторовврожденногоиммунитета,которыемогутбытьассоциированы с риском развития преждевременных родов или с реализациейвнутриутробной инфекции.В данном исследовании нами был выбран полиморфный маркер G(-20)Aгена DEFB1, расположенный в нетранслируемой области.
Предположительно этотSNPs может влиять на уровень экспрессии гена дефенсина.Анализ частот аллелей и генотипов полиморфного маркера G(-20)A уродильниц в исследуемых группах выявил некоторые достоверные различия. Так,частоты аллелей данного маркера в группе с внутриутробным инфицированиемплода и в группе сравнения были следующими: аллель G - 0,66, 0,79, аллель А 0,34, 0,21, соответственно. Частота аллелей у родильниц, у которых родилисьноворожденныес ВУП, достоверно не отличались от таковых в группесравнения. Таким образом, аллель А (определяемая у родильниц) являетсямаркером ВУП.Частоты генотипов исследуемого маркера у родильниц в группе ВУП, РНПи группе сравнения были следующими: GG - 0,78, 0,58, 0,58; AA – 0, 0,25, 0; AG 0,22, 0,17, 0,42, соответственно.
Показано, что в дагестанской популяциидоминировал аллель G и генотип GG (частота составляла более 0,58). Было263выявлено,чторискразвитиявнутриутробногоинфицированияплодаассоциирован с генотипом АА у родильниц, а генотип AG – является«протективным».У новорожденных также проводили исследование ассоциации маркера G(20)A гена DEFB1 с риском развития ВУП и РНП. Среди аллелей доминировалаллель G (частота была выше 0,73 во всех группах) и генотип GG (частотапревышала 0,52).
Такая же тенденция была определена и у родильниц. Однакоассоциаций аллелей и генотипов маркера G(-20)A у новорожденных с патологиейне было выявлено.Полученные результаты указывают на то, что генетический маркер G(-20)Aгена DEFB1 ассоциирован с риском развития ВУП у новорожденного.В данном исследовании было выбрано три цитокина: IL-10, IL-17 и TNFa,генетические маркеры, которые могут быть ассоциированы с риском развитияпневмонии.Помимо провоспалительных цитокинов в работе также был исследованпротивоспалительный цитокин - IL-10.
Нами был проведен сравнительный анализраспределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров TNFА (-308 G/A) иIL17A (-197 G/A), которые локализованы в промоутерных областях генов. Частоизменения последовательности ДНК в промоутерной области гена связано сизменением экспрессии белка.Во всех группах доминировал аллель А и гетерозиготный генотип.
При этомдостоверных различий между частотами аллелей и генотипов в группах спневмонией новорожденных, внутриутробным инфицированием и группойсравнения в материале от родильниц выявлено не было.Иная тенденция наблюдалась непосредственно у новорожденных. Аллели вматериале от новорожденных во всех группах распределились приблизительноодинаково.Вгруппеноворожденныхспневмониейопределялидостоверноеувеличение частоты генотипа GG, которая составляла 0,18 относительно 0,04 – вгруппе сравнения.264Таким образом, маркер GG TNFА (-308 G/A) ассоциирован с рискомразвития пневмонии у новорожденных и может быть использован в практике.Вероятно, наличие данной замены в геноме новорожденных может быть связанос нарушением баланса выработки TNFα и нарушением защиты.Другой провоспалительный цитокин, который был исследован в работе IL17.В клиническом материале от родильниц распределение частот аллелейсреди исследуемых групп было следующее: аллель А – 0,26; 0,31 и 0,34, аллель G– 0,74; 0,69 и 0,66 в группах сравнения, ВУП и РНП, соответственно.Достоверных различий при этом не было определено.
При исследовании частотгенотипов было выявлено два маркера – генотип GG был ассоциирован сотсутствием развития внутриутробной инфекции, т.е. можно считать его«протективным». В то же время наличие генотипа GА ассоциировано с развитиеминфекции у плода. Можно предположить, что нарушение экспрессии цитокинаIL17 у родильницы может служить причиной инфицирования плода.На следующем этапе были исследованы полиморфные маркеры (-1082A>G)и(-592A>C)вгенеIL10.Какужеговорилосьранее,IL10–противовоспалительный цитокин и изменения в его промоутерной области могутпривести к изменению экспрессии белка и к нарушению баланса про- ипротивовоспалительных цитокинов.Во всех исследуемых группах определялись аллели полиморфного маркераIL10 (-1082 A>G), но достоверных изменений в распределении не былообнаружено. У родильниц выявлено, что генотип GA (частота которого составила0,75, относительно 0,47 – в группе сравнения) ассоциирован с развитиемпневмонии у новорожденных.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
