Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1139475), страница 7

Файл №1139475 Диссертация (Хирургическое лечение деструктивного туберкулеза легких у больных с множественной и широкой лекарственной устойчивостью микобактерий) 7 страницаДиссертация (1139475) страница 72019-05-31СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 7)

Метод состоит из двух этапов: напервом этапе проводят амплификацию искомого фрагмента гена, на второмэтапе полученные ампликоны разделяют при помощи вертикальногоэлектрофорезаввысокоразрешающемполиакриламидномгелеприпониженной температуре [195]. ПЦР-SSCP позволяет быстро детектироватьналичие резистентности к рифампицину и изониазиду.

С помощью этогометода можно выявить мутацию, но для определения ее типа необходимопроводить секвенирование или иметь контрольные штаммы МБТ сизвестными мутациями в исследуемых кодонах.37DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) - метод денатурирующегоградиентного гель-электрофореза — основан на зависимости свойствденатурации небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотиднойпоследовательности, а точнее - от соотношения А-Т иГ-Ц-пар висследуемых фрагментах [189]. В отличие от SSCP, он пригоден для анализаболее крупных амплифицированных фрагментов ДНК. При исследованиифрагментов до 600 п.н. эффективность выявления мутаций этим методомдостигает 95%.Принцип метода ПЦР-гетеродуплексного анализа (ГДА)основан на сравнении электрофоретической подвижности гетеродуплексов,полученных при гибридизации соответствующих участков ДНК референсштаммаН37Rvиизучаемогоштамма.Электрофорезпроводятвполиакриламидном геле.

Вероятность определения точечных мутаций этимспособом на фрагментах ДНК менее 300 п.н. достигает 80 - 90%. Детекциямутаций осуществляется как изотопными, так и неизотопными методами[194].Система GeneXpert позволяет проводить анализ на наличие Mycobacteriumtuberculosis и ее резистентности к рифампицину при помощи теста XpertMTB/RIF(Cepheid,США).ТестXpertMTB/RIFявляетсяполуколичественной гнездной ПЦР в реальном времени in vitro. GeneXpertвключаетавтоматизированнуюобработкуобразцов,амплификациюнуклеиновых кислот и определение интересующей последовательности впростых или сложных образцах с использованием методов ПЦР в реальномвременииПЦРдиагностическогособратнойустройства,транскриптазой.персональногоСистемасостоиткомпьютера,изсканераштриховых кодов и программного обеспечения для проведения тестов ипросмотра их результатов. Результаты обнаружения ДНК микобактерийтуберкулезасодновременнымопределениемлекарственнойчувствительности к рифампицину могут быть получены в течение 2,5 часов.Ещеоднимдостоинствомданнойтехнологииявляетсяотсутствие38необходимости в полноценной ПЦР-лаборатории и специально обученномперсонале.

Однако пропускная способность метода небольшая: параллельноэтим методом может быть исследовано от 2 до 16 образцов мокроты [287,481].Биологическиемикрочипы(биочипы)представляютсобойупорядоченные библиотеки олигонуклеотидных зондов, нанесенные спомощью роботов или синтезированные in situ на поверхности твердойподложки (стекло, нейлоновая мембрана, силикон или пластик) такимобразом, что каждый элемент такого микрочипа содержит индивидуальныйзонд с известной последовательностью [8].

Оригинальный подход к созданиюбиочипов, разрабатываемый Институтом молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (ООО «Биочип») с 1988 года, ориентирован наопределение последовательности ДНК новым методом секвенированияпутем гибридизации с библиотекой иммобилизованных олигонуклеотидныхзондов. Сущность метода заключается в том, что олигонуклеотидные зондыиммобилизованы не на поверхности подложки, а в трехмерном объемегидрофильного геля. Подобный подход обладает целым рядом преимуществ.Во-первых, емкость трехмерных ячеек в отношении иммобилизованногоолигонуклеотида гораздо выше, чем при двумерной иммобилизации, чтозначительноповышаетиммобилизациичувствительностьиспользуютсяанализа.индивидуальныеВо-вторых,высокодляочищенныеолигонуклеотиды, в то время как при синтезе олигонуклеотидов in situтолько 40% (при длине 10 оснований) или 15% (при длине 20) отиммобилизованных олигонуклеотидов будут полноразмерными.

Такимобразом, предварительная очистка олигонуклеотидов позволяет значительноулучшитьнадежностьсебестоимостьгибридизацииисдаетопределенияпоследовательности,возможностьинтерпретироватьрезультатыаппаратнопрограммныхкомплексов,использованиемснижаетстоимость которых на порядок ниже, чем зарубежных аналогов [8].Результаты гибридизации регистрируют на портативном анализаторе39биочипов – «Чипдетекторе» с соответствующим программным обеспечением[195].Для определения ЛЧ МБТ было разработано два варианта биочипов:«ТББиочип» - инструмент для детекции МБТ (определение генетическогомаркера IS6110) c одновременным определением чувствительности МБТ крифампицину и изониазиду (выявление наиболее значимых мутаций в генахrроВ (27 типов), katG (11), inhA (5) и ahpС (5)) и «ТБ-БИОЧИП-2» инструмент для определения ЛЧ МБТ к фторхинолонам (выявление 9 типовзначимых мутаций в гене gyrA) [9].

Время определения - 9-24 часа (2-3рабочих дня, учитывая 6-часовой рабочий день). Результаты определения ЛЧМБТ к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам, полученные при помощиметода биочипов, обладают высокой степенью корреляции с результатамиопределения ЛЧ к ПТП традиционным методом и могут быть получены взначительно более короткие сроки. По данным литературы, детекция ЛЧМБТ в клинических образцах при помощи гибридизации на биочипаххорошо коррелировала с результатами бактериологических тестов [8,27].Line probe assay (Lipa) - метод, основанный на принципе твердофазноймножественной обратной гибридизации. В основе метода лежит ПЦР сбиотинилированными праймерами, ограничивающими участки генов, вкоторых возможно возникновение искомых мутаций.

После полученияампликонов проводят множественную обратную гибридизацию на стриповыхмембранах-полосках,накоторыхиммобилизованыискусственносинтезированные нуклеотиды, содержащие или не содержащие мутации. Взависимости от того, содержит ли выделенная ДНК мутации или нет,ампликоны будут гибридизоваться с олигонуклеотидами с мутациями илибез.

После гибридизации следуют процедуры отмывки от несвязавшихсяпродуктов и проявление гибридизационных полос, окрашенных в пурпурныйили коричневый цвет. Результат считывается вручную или автоматически вспециальном анализаторе. Время получения результата - 1-2 дня (6 часов)40[280, 493, 494]. На российском рынке технология представлена германскойфирмойHainLifescience(Hain-тесты).Фирмавыпускаеттестынаопределение мутаций, ответственных за возникновение устойчивости крифампицину и изониазиду (GenoType®MTBDRplus), а также этамбутолу,фторхинолонам и аминогликозидам (GenoType®MTBDRsl).

Также данныйметод используют в коммерческих наборах INNO-Lipa, производимыхфирмой «INNOGENETICS» (Бельгия). По литературным данным результатысравненияданныхоЛУМБТ,полученныеметодомабсолютныхконцентраций и Наin-тестов, а также методом биочипов и Наin-тестовсовпадают в большом проценте случаев [104]. Метод идеально подходит дляопределения мутаций для большинства штаммов МБТ, но он не детектируетвставки, делеции и мутации в регионах, которые не покрываютсяиспользуемыми зондами. Поэтому данный метод может быть использованкак скрининговый, но отрицательный результат должен быть проверендругими методами [291].Молекулярно-генетические методы определения ЛЧ МБТ по быстротеполучения результатов стоят на первом месте.

Тем не менее, полностьюотказатьсяотмикробиологическихметодовопределенияЛЧпоканевозможно, так как не для всех ПТП найдены генетические механизмыформирования ЛУ. К тому же, высокую сходимость с результатамифенотипической ЛЧ показали молекулярные тесты на ЛЧ к изониазиду,рифампицинуифторхинолонам,однако,чтокасаетсяэтамбутола,аминогликозидов и циклических пептидов, молекулярные методы оказалисьменее точными, совпадения не превыш 50-80%.

Также в некоторых образцахвозможно присутствие нескольких штаммов МБТ, обладающих различнойЛУ к ПТП. Правильно их идентифицировать позволит только одновременноетестирование несколькими методами, одним из которых должен бытьмолекулярно-биологическй, другим – традиционный бактериологический сиспользованием различных концентраций ПТП. Кроме того, результаты,41полученные при одновременном применении нескольких подходов, могутоказатьсяполезнымиингибирующейдляизученияконцентрацииПТПзависимостиминимальноймутации,определяющейотрезистентность [194].1.4 Результаты консервативного лечения МЛУ и ШЛУ – туберкулезаорганов дыханияНеобходимо отметить, что в настоящее время отмечается не толькоувеличение числа больных ЛУТ, происходит изменение самой структурыЛУ, если в начале истории применения ПТП наиболее часто встречаласьмонорезистентность МБТ к ПТП, то на современном этапе наблюдаетсязначительный рост числа больных полирезистентным и МЛУ/ШЛУтуберкулезом легких, что напрямую связано с длительным использованиемосновных и резервных препаратов, и с отсутствием достаточного количествановых эффективных ПТП.устойчивоготуберкулезасМеняется и патоморфоз лекарственноувеличениемчислапрогрессирующихиостропрогрессирующих форм туберкулеза [1, 36, 58, 74, 84, 91, 101, 175].

Поданным СDС (центр по контролю за инфекционными заболеваниями) в 2006г. случаи XDR-TB были зарегистрированы в 17 странах [397]. По подсчетамВОЗ каждый год в мире появляется около 27000 вновь заболевших XDR-TB.Только 27% больных данной группы были вылечены, а большинство случаевзакончились гибелью больных. На 2008 год уже в 45 странах мира выявленыи подтверждены случаи ШЛУ-туберкулеза, в 2012 году – в 84, в 2014 - 92, в2015 - в 105 странах и в 2016 - в 121 стране [508, 512, 513, 517].С момента возникновения МЛУ/ШЛУ туберкулеза и до настоящеговремени проблема повышения эффективности лечения остается крайнеактуальной. В РФ в 2013 году эффективность лечения больных с МЛУ МБТсоставила 38,1%, с ШЛУ МБТ - 26,2% [202].

Характеристики

Список файлов диссертации

Хирургическое лечение деструктивного туберкулеза легких у больных с множественной и широкой лекарственной устойчивостью микобактерий
Свежие статьи
Популярно сейчас
Зачем заказывать выполнение своего задания, если оно уже было выполнено много много раз? Его можно просто купить или даже скачать бесплатно на СтудИзбе. Найдите нужный учебный материал у нас!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6384
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее