Диссертация (1139475), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Метод состоит из двух этапов: напервом этапе проводят амплификацию искомого фрагмента гена, на второмэтапе полученные ампликоны разделяют при помощи вертикальногоэлектрофорезаввысокоразрешающемполиакриламидномгелеприпониженной температуре [195]. ПЦР-SSCP позволяет быстро детектироватьналичие резистентности к рифампицину и изониазиду.
С помощью этогометода можно выявить мутацию, но для определения ее типа необходимопроводить секвенирование или иметь контрольные штаммы МБТ сизвестными мутациями в исследуемых кодонах.37DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) - метод денатурирующегоградиентного гель-электрофореза — основан на зависимости свойствденатурации небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотиднойпоследовательности, а точнее - от соотношения А-Т иГ-Ц-пар висследуемых фрагментах [189]. В отличие от SSCP, он пригоден для анализаболее крупных амплифицированных фрагментов ДНК. При исследованиифрагментов до 600 п.н. эффективность выявления мутаций этим методомдостигает 95%.Принцип метода ПЦР-гетеродуплексного анализа (ГДА)основан на сравнении электрофоретической подвижности гетеродуплексов,полученных при гибридизации соответствующих участков ДНК референсштаммаН37Rvиизучаемогоштамма.Электрофорезпроводятвполиакриламидном геле.
Вероятность определения точечных мутаций этимспособом на фрагментах ДНК менее 300 п.н. достигает 80 - 90%. Детекциямутаций осуществляется как изотопными, так и неизотопными методами[194].Система GeneXpert позволяет проводить анализ на наличие Mycobacteriumtuberculosis и ее резистентности к рифампицину при помощи теста XpertMTB/RIF(Cepheid,США).ТестXpertMTB/RIFявляетсяполуколичественной гнездной ПЦР в реальном времени in vitro. GeneXpertвключаетавтоматизированнуюобработкуобразцов,амплификациюнуклеиновых кислот и определение интересующей последовательности впростых или сложных образцах с использованием методов ПЦР в реальномвременииПЦРдиагностическогособратнойустройства,транскриптазой.персональногоСистемасостоиткомпьютера,изсканераштриховых кодов и программного обеспечения для проведения тестов ипросмотра их результатов. Результаты обнаружения ДНК микобактерийтуберкулезасодновременнымопределениемлекарственнойчувствительности к рифампицину могут быть получены в течение 2,5 часов.Ещеоднимдостоинствомданнойтехнологииявляетсяотсутствие38необходимости в полноценной ПЦР-лаборатории и специально обученномперсонале.
Однако пропускная способность метода небольшая: параллельноэтим методом может быть исследовано от 2 до 16 образцов мокроты [287,481].Биологическиемикрочипы(биочипы)представляютсобойупорядоченные библиотеки олигонуклеотидных зондов, нанесенные спомощью роботов или синтезированные in situ на поверхности твердойподложки (стекло, нейлоновая мембрана, силикон или пластик) такимобразом, что каждый элемент такого микрочипа содержит индивидуальныйзонд с известной последовательностью [8].
Оригинальный подход к созданиюбиочипов, разрабатываемый Институтом молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (ООО «Биочип») с 1988 года, ориентирован наопределение последовательности ДНК новым методом секвенированияпутем гибридизации с библиотекой иммобилизованных олигонуклеотидныхзондов. Сущность метода заключается в том, что олигонуклеотидные зондыиммобилизованы не на поверхности подложки, а в трехмерном объемегидрофильного геля. Подобный подход обладает целым рядом преимуществ.Во-первых, емкость трехмерных ячеек в отношении иммобилизованногоолигонуклеотида гораздо выше, чем при двумерной иммобилизации, чтозначительноповышаетиммобилизациичувствительностьиспользуютсяанализа.индивидуальныеВо-вторых,высокодляочищенныеолигонуклеотиды, в то время как при синтезе олигонуклеотидов in situтолько 40% (при длине 10 оснований) или 15% (при длине 20) отиммобилизованных олигонуклеотидов будут полноразмерными.
Такимобразом, предварительная очистка олигонуклеотидов позволяет значительноулучшитьнадежностьсебестоимостьгибридизацииисдаетопределенияпоследовательности,возможностьинтерпретироватьрезультатыаппаратнопрограммныхкомплексов,использованиемснижаетстоимость которых на порядок ниже, чем зарубежных аналогов [8].Результаты гибридизации регистрируют на портативном анализаторе39биочипов – «Чипдетекторе» с соответствующим программным обеспечением[195].Для определения ЛЧ МБТ было разработано два варианта биочипов:«ТББиочип» - инструмент для детекции МБТ (определение генетическогомаркера IS6110) c одновременным определением чувствительности МБТ крифампицину и изониазиду (выявление наиболее значимых мутаций в генахrроВ (27 типов), katG (11), inhA (5) и ahpС (5)) и «ТБ-БИОЧИП-2» инструмент для определения ЛЧ МБТ к фторхинолонам (выявление 9 типовзначимых мутаций в гене gyrA) [9].
Время определения - 9-24 часа (2-3рабочих дня, учитывая 6-часовой рабочий день). Результаты определения ЛЧМБТ к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам, полученные при помощиметода биочипов, обладают высокой степенью корреляции с результатамиопределения ЛЧ к ПТП традиционным методом и могут быть получены взначительно более короткие сроки. По данным литературы, детекция ЛЧМБТ в клинических образцах при помощи гибридизации на биочипаххорошо коррелировала с результатами бактериологических тестов [8,27].Line probe assay (Lipa) - метод, основанный на принципе твердофазноймножественной обратной гибридизации. В основе метода лежит ПЦР сбиотинилированными праймерами, ограничивающими участки генов, вкоторых возможно возникновение искомых мутаций.
После полученияампликонов проводят множественную обратную гибридизацию на стриповыхмембранах-полосках,накоторыхиммобилизованыискусственносинтезированные нуклеотиды, содержащие или не содержащие мутации. Взависимости от того, содержит ли выделенная ДНК мутации или нет,ампликоны будут гибридизоваться с олигонуклеотидами с мутациями илибез.
После гибридизации следуют процедуры отмывки от несвязавшихсяпродуктов и проявление гибридизационных полос, окрашенных в пурпурныйили коричневый цвет. Результат считывается вручную или автоматически вспециальном анализаторе. Время получения результата - 1-2 дня (6 часов)40[280, 493, 494]. На российском рынке технология представлена германскойфирмойHainLifescience(Hain-тесты).Фирмавыпускаеттестынаопределение мутаций, ответственных за возникновение устойчивости крифампицину и изониазиду (GenoType®MTBDRplus), а также этамбутолу,фторхинолонам и аминогликозидам (GenoType®MTBDRsl).
Также данныйметод используют в коммерческих наборах INNO-Lipa, производимыхфирмой «INNOGENETICS» (Бельгия). По литературным данным результатысравненияданныхоЛУМБТ,полученныеметодомабсолютныхконцентраций и Наin-тестов, а также методом биочипов и Наin-тестовсовпадают в большом проценте случаев [104]. Метод идеально подходит дляопределения мутаций для большинства штаммов МБТ, но он не детектируетвставки, делеции и мутации в регионах, которые не покрываютсяиспользуемыми зондами. Поэтому данный метод может быть использованкак скрининговый, но отрицательный результат должен быть проверендругими методами [291].Молекулярно-генетические методы определения ЛЧ МБТ по быстротеполучения результатов стоят на первом месте.
Тем не менее, полностьюотказатьсяотмикробиологическихметодовопределенияЛЧпоканевозможно, так как не для всех ПТП найдены генетические механизмыформирования ЛУ. К тому же, высокую сходимость с результатамифенотипической ЛЧ показали молекулярные тесты на ЛЧ к изониазиду,рифампицинуифторхинолонам,однако,чтокасаетсяэтамбутола,аминогликозидов и циклических пептидов, молекулярные методы оказалисьменее точными, совпадения не превыш 50-80%.
Также в некоторых образцахвозможно присутствие нескольких штаммов МБТ, обладающих различнойЛУ к ПТП. Правильно их идентифицировать позволит только одновременноетестирование несколькими методами, одним из которых должен бытьмолекулярно-биологическй, другим – традиционный бактериологический сиспользованием различных концентраций ПТП. Кроме того, результаты,41полученные при одновременном применении нескольких подходов, могутоказатьсяполезнымиингибирующейдляизученияконцентрацииПТПзависимостиминимальноймутации,определяющейотрезистентность [194].1.4 Результаты консервативного лечения МЛУ и ШЛУ – туберкулезаорганов дыханияНеобходимо отметить, что в настоящее время отмечается не толькоувеличение числа больных ЛУТ, происходит изменение самой структурыЛУ, если в начале истории применения ПТП наиболее часто встречаласьмонорезистентность МБТ к ПТП, то на современном этапе наблюдаетсязначительный рост числа больных полирезистентным и МЛУ/ШЛУтуберкулезом легких, что напрямую связано с длительным использованиемосновных и резервных препаратов, и с отсутствием достаточного количествановых эффективных ПТП.устойчивоготуберкулезасМеняется и патоморфоз лекарственноувеличениемчислапрогрессирующихиостропрогрессирующих форм туберкулеза [1, 36, 58, 74, 84, 91, 101, 175].
Поданным СDС (центр по контролю за инфекционными заболеваниями) в 2006г. случаи XDR-TB были зарегистрированы в 17 странах [397]. По подсчетамВОЗ каждый год в мире появляется около 27000 вновь заболевших XDR-TB.Только 27% больных данной группы были вылечены, а большинство случаевзакончились гибелью больных. На 2008 год уже в 45 странах мира выявленыи подтверждены случаи ШЛУ-туберкулеза, в 2012 году – в 84, в 2014 - 92, в2015 - в 105 странах и в 2016 - в 121 стране [508, 512, 513, 517].С момента возникновения МЛУ/ШЛУ туберкулеза и до настоящеговремени проблема повышения эффективности лечения остается крайнеактуальной. В РФ в 2013 году эффективность лечения больных с МЛУ МБТсоставила 38,1%, с ШЛУ МБТ - 26,2% [202].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
