Диссертация (1139475), страница 6
Текст из файла (страница 6)
При добавлении реактива Грисса в пробирку, гдеимеется рост МБТ, происходит нитратредуктазная реакция, приводящая кизменению цвета реактива Грисса и питательной среды с конденсатом [56,171].Совпадениерезультатовприиспользованиитрадиционногоиускоренного методов определения ЛЧ МБТ составляет 96,6% [56,87]. Такимобразом,нитратредуктазныйметодопределенияЛЧМБТявляетсядостаточно точным и не уступает по чувствительности традиционномуметоду абсолютных концентраций, обеспечивая полноценное определениеспектра ЛУ.Метод коэффициента устойчивости.
Сущность метода заключается вопределенииминимальнойингибирующейконцентрацииПТПдляклинических штаммов МБТ и соотношения минимальной ингибирующейконцентрациитехжепрепаратовдлязаведомочувствительноголабораторного штамма микобактерий (как правило, H37Rv). Это самыйтрудозатратный и дорогостоящий метод, так как требует использованиябольшого количества пробирок с питательной средой, поэтому онприменяется в основном в научных исследованиях [87].В настоящее время традиционная микробиологическая диагностика ЛУМБТ к ПТП на плотных питательных средах требует длительного времени ибольших трудозатрат, что существенно удорожает метод и делаетневозможным стандартизировать методологию приготовления яичных сред.Частично это связано с тем, что в зависимости от условий содержания ипитания кур в птицеводческих хозяйствах яйца для питательных сред могутотличаться как по размерам, так и по содержанию и качеству желтка,который, в свою очередь, может оказать существенное влияние на скоростьроста МБТ на питательной среде [142].32За последнее десятилетие современный диагностический арсеналзначительно расширился за счет ускоренных культуральных методов.
Внастоящее время для сокращения сроков выращивания МБТ и ускоренногоопределения ЛУ широко применяются методы с использованием жидкихпитательных сред и автоматизированных систем: BACTEC 460 МТВ system(Becton Dickinson), ВАСТЕС MGIT 960 (Becton Dickinson), ВАСТЕС 9000МВ (Becton Dickinson), МВ/ВасТ (Organon Teknika), ВасТ/Alert 3D(BioMerieux), VersaTREK и другие.
Указанные системы осуществляютпостоянный компьютерный мониторинг роста бактериальной популяции вобогащенной жидкой питательной среде Middlebrook 7H9 и сигнализируют онакоплении минимального количества микроорганизмов. Кроме сокращениявремени диагностики, системы обладают высокой воспроизводимостью и,следовательно, внедрение их в лабораторную практику позволяет повыситькачестводиагностикимаксимально[56].стандартизируетПрименениеметодику,автоматизированныхтаккаксистемреактивыдляпробоподготовки и компоненты питательных сред производят в заводскихусловиях на контролируемом производстве.
Однако широкое применениекультурального метода с использованием автоматизированных системзатруднено из-за дорогостоящего оборудования и питательных сред.ВАСТЕС 460 МТВ system - первая полуавтоматическая тест-система нажидких средах, позволяет получить результат ЛЧ МБТ в срок 18-30 дней (2-3недели – выделение МБТ и следующие 4-7 дней - определение ЛЧ).
Системаиспользует жидкую среду Middlebrook 7H12. Рост МБТ в ней определяетсяпутем регистрации уровня радиоактивно меченного СО2, который образуетсяв процессе микробной утилизации субстрата с пальмитиновой кислотой,содержащей радиоактивный 14С. Степень накопления МБТ определяется спомощью индекса роста в среде с известной концентрацией ПТП. Виндустриально развитых странах система BACTEC 460 получила широкоераспространение и стала своеобразным референс-методом для вновь33создаваемых систем бульонного культивирования [345,430]. При очевидныхдостоинствах радиометрическая система BACTEC 460 имеет ряд недостатков– таких, как полуавтоматический мониторинг роста культуры, значительнаятрудоемкость операции, работа с радиоизотопами и необходимостьутилизации радиоактивных отходов.
Для их преодоления в середине 90-хгодов прошлого столетия была предложена более совершенная технологияфлуоресцентной регистрации роста микроорганизмов, которая легла в основуразработки автоматической системы BACTEC MGIT 960.BACTEC MGIT 960 работает на принципах технологии MGIT, котораясодержит модифицированную среду Миддлбрук 7H9 с входящим в неефлюоресцентным индикатором роста (трис-4,7-дифенил-1,10-фенантролинарутениумхлоридпентагидрат), заключенным под силиконом на дне пробиркии погашенным высокой концентрацией кислорода, растворенного в среде.
Впроцессе развития микробная популяция активно поглощает кислород, чтоприводитквысвобождениюначинаетсветитьсяприфлюоресцентногоультрафиолетовомкомпонента,облучении.которыйУвеличениемикробной популяции сопровождается усилением свечения, интенсивностькоторого можно оценить при помощи трансиллюминатора или портативногосветоизмерительногоосуществляетприборавстроенныйвMicromgit,приборконтролькомпьютер.надматериаломУскоренныйросткислотоустойчивых бактерий обеспечивается дополнительным внесениемжидкой обогатительной добавки (олеиновая кислота, альбумин, декстроза икаталаза). Для предотвращения контаминации добавляется смесь пятиантибиотиков, которые вносятся в индикаторную пробирку перед посевом.Штамм считается резистентным, если рост детектируется в контрольнойпробирке и в пробирке, содержащей ПТП. Детекция занимает от 3 до 14 дней,вместе с тестом на ЛЧ от 24 до 30 дней.
Одна из коммерчески доступныхсистем МВ/ВасТ была запатентована голландской фирмой Organon Teknika в1995 г. Она представляет полностью автоматическую систему (постоянный34мониторинг сигнала роста) с быстрой неинвазивной колориметрическойСО2-детекцией. Уникальные MB/BacT флаконы содержат придонный сенсор,изменение цвета которого наблюдается при закислении среды вследствиемикробного метаболизма, что регистрируется компьютером. Положительныйрезультат, свидетельствующий о росте МБТ, регистрируется системой втечение 2-3 недель, отрицательный – 42 дней. Время теста на определениеЛЧ занимает 9 дней. При использовании данной системы отсутствуютнеобходимость в радиоизотопах и риск кроссконтаминации при регистрациирезультатов.
Другим более совершенным представителем вышеописанногосемейства является система нового поколения ВасТ Alert 3D, которуюпредставляет компания BioMerieus.Такимобразом,применениебактериологическихметодовдляопределения ЛЧ МБТ имеет основной недостаток – длительность проведенияанализа. Применение автоматизированных аппаратов с жидкими средамипозволяет сократить время определения ЛУ МБТ, однако себестоимостьанализадостаточновысока,такженеобходимоподтверждениеспецифичности роста МБТ, полученного на жидкой среде [292].1.3.2. Молекулярно-генетические методы определения лекарственнойчувствительности микобактерий туберкулезаЗадачи МГМ определения ЛЧ или ЛУ МБТ сводятся к выявлениюспецифических полиморфизмов (мутаций в определенных нуклеотидныхпоследовательностяхизвестныхгенов),найденныхурезистентныхмикобактерий и отсутствующих у чувствительных штаммов МБТ [31, 42, 226,405].Основныеметодыоснованылибонапрямомпрочитывании(секвенировании) этих последовательностей после амплификации, либо нагибридизации биотин-меченых фрагментов ДНК, амплифицированных входе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с ДНК-зондами.
Оба вариантапредполагают выявление замен в нуклеотидных последовательностях,35которые при использовании ДНК-зондов приводят к отсутствию илинеполноценной гибридизации [31].Методы, основанные на секвенировании.Секвенирование – это«золотой стандарт» поиска альтераций в геноме организмов, которыйзаключается в расшифровке последовательности нуклеотидов, составляющихДНК. Метод позволяет не только точно локализовать мутацию в исследуемойпоследовательности нуклеотидов, но и определить ее тип [164]. В последниегоды происходит настоящий «бум» в развитии этой технологии – появляются«настольные» приборы для полногеномного секвенирования, позволяющиеза 1 рабочий день расшифровать весь геном организма.
Однако расходныереагенты для такого анализа слишком дороги. При условии снижениястоимости анализа секвенирование может стать незаменимым инструментомне только в научных исследованиях, но и в клинической лабораторнойпрактике.Методы, основанные на ПЦР. Заключаются в считывании нуклеотидныхпоследовательностей ДНК хорошо изученных генов, ответственных за ЛУ.ПЦРврежимеРасшифровкареальноговремени(аллель-специфическаяспецифическихучастковДНКпозволяетПЦР).установитьопределенные точки мутаций, которые приводят к изменениям структурырецептора лекарственного агента и потере ЛЧ МБТ.
Если анализируемыйобразец не содержит мутаций, то будет идти ПЦР с прямым и обратнымпраймерами, не мечеными и не содержащими мутаций, и нарастаниефлюоресценциибудетнаблюдатьсятолькопофлюорофоругибридизационного зонда. Если образец содержит мутацию, то нарастаниефлюоресценции будет наблюдаться по флюорофору гибридизационногозонда, и по флюорофору 5`-флюоресцентно-меченного аллель-специфичногопраймера, который будет встраиваться вместо обычного праймера, несодержащего мутации. Преимуществами данной технологии являются:значительное снижение времени проведения анализа, удешевление анализа,36снижение риска контаминации, высокая чувствительность и возможностьполучить информацию о присутствии в образце смешанных популяциймикобактерий (ЛЧ и ЛУ).
На сегодняшний день метод ПЦР в реальномвремени является самым быстрым методом, так как результат можнопроанализировать непосредственно по окончанию реакции, не проводяэлектрофореза,гибридизацииилиещеоднойстадииПЦР.Времяопределения - 3часа (включая выделение ДНК) [30]. На российском рынкеданная методика представлена в наборах фирмы «Синтол» (Россия), которыеобеспечивают определение мутаций в генах, ответственных за возникновениеустойчивости к изониазиду и рифампицину (набор «Амплитуб-МЛУ-РВ»).Также существует набор на выявление мутаций в генах, отвечающих за ЛУ кэтамбутолу, аминогликозидам, циклическим пептидам и фторхинолонам.Сопоставление данных о ЛЧ МБТ, полученных при помощи ПЦР в реальномвремени, с результатами бактериологического исследования методомабсолютныхконцентраций ис помощью системы Bactec выявилоконкордантность методов в среднем в 94% и 90%, соответственно [31].SSCP(SingleStrandConformationPolymorphism)-методанализаконформационного полиморфизма ДНК основан на регистрации различий вэлектрофоретической подвижности одноцепочечных ДНК, одинаковых повеличине,норазличающихсявследствиенуклеотидныхзаменпопространственной организации молекул.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
