Диссертация (1139475), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Стрептомицинсвязывается с 16S субъединицей рибосомы, ингибируя трансляцию и какследствие синтез белка. Мутации, ассоциированные с устойчивостью кстрептомицину, обнаружены в гене 16S рРНК (rrs) и рибосомального белкаS12, кодируемого геном rpsL [465]. Низкий уровень устойчивости кстрептомицину, также возникает из-за появления мутации в гене gidB,кодирующемконсервативную7-метил-гуанозин-метилтрансферазу,специфичную для 16S рРНК [511].Канамицин и его производное – амикацин, как представители антибиотиковкласса аминогликозидов, действуют на те же мишени что и стрептомицин, ноустойчивость к ним достигается за счет других мутаций в генах rrs и rpsL[269] Несмотря на то, что стрептомицин имеет ту же мишень, эффективностьдействияканамицинаотличаетсяотстрептомицинаблагодаряегохимической структуре [346].Капреомицин, хотя и относится к другому классу антибиотиков (циклическиепептиды), тем не менее, объединяется в одну группу с аминогликозидами,поскольку также является ингибитором белкового синтеза.
В исследованияхSuzuki и Taniguchi устойчивость к капреомицину связывалась с мутациями вгене, кодирующем 16S рРНК [469], однако позже было выявлено, что,помимо этого, резистентность к данному препарату может быть обусловленамодификацией специфичной для рРНК метилтрансферазы, кодируемойгеном tlyA. Вследствие мутаций в этом гене происходит потеря метилазнойактивностифермента,и,следовательно,неметилированной рРНК с антибиотиком [392].нарушаетсясвязывание26На сегодняшний день имеются противоречивые данные о перекрестнойустойчивости среди препаратов этой группы. Одно из первых исследованийподаннойпроблеме,свидетельствовалоопроведенноеналичииС.Tsukamuraперекрестнойв1975устойчивостигоду,междуканамицином и капреомицином [485].
Ряд дальнейших исследованийподтвердили эту гипотезу, также выявив различную степень перекрестнойустойчивости между канамицином и амикацином, между канамицином икапреомицином [269, 392]. Однако в 2003 году Krüüner с соавторами былопродемонстрированосуществованиештаммовM.tuberculosisсрасходящимися показателями чувствительности к амикацину и канамицину[371].Отсутствиеперекрестнойустойчивостимеждудвумяэтимипрепаратами у ряда штаммов говорит о существовании других механизмов,определяющихустойчивостьвданнойситуации.Болеедетальныеисследования показали, что причиной устойчивости к канамицину можетбыть наличие мутаций в промоторе гена eis, который кодирует специфичнуюацетилтрансферазу.
Суперэкспрессия этого гена приводит к значительномуповышению в клетке концентрации фермента, способного ацетилировать и,тем самым, инактивировать антибиотик. Несмотря на то, что продукт генаeis обладает некоторой активностью и в отношении амикацина, штаммы,несущие мутации в этом гене сохраняют чувствительность к нему. Такимобразом, мутации в гене eis обеспечивают устойчивость только к канамицину[526].
Такие штаммы широко распространены в России и странахПрибалтики, где канамицин широко используется как для терапиитуберкулеза, так и других инфекций [371,294]. Основной причинойрасходящихся данных по перекрестной ЛУ среди препаратов этой группы,видимо, является генетическая неоднородность циркулирующих в разныхрегионах штаммов, которая подразумевает различную частоту встречаемостимутаций в тех или иных генах, что, в свою очередь, может определятьсяразличиями в применяемых схемах лечения больных туберкулезом.27Устойчивость к пиразинамидуПреимуществом пиразинамида является способность влиять на дормантныеклетки, персистирующие в кислой среде макрофагов [400]. Пиразинамидявляется про-лекарством, структурным аналогом никотинамида, и дляосуществления своей функции должен преобразоваться в пиразиновуюкислоту (POA) с помощью фермента пиразинамидазы, кодируемой геномpncA [449].
Было обнаружено, что около 97% всех случаев пиразинамидустойчивости обусловлено мутациями в гене pncA [349]. В работе [454]установлена мишень пиразиновой кислоты – рибосомальный белок S1,кодируемый геном rpsA, вовлеченный в процессы трансляции и транстрансляции при спаривании субъединиц рибосомы. Пиразиновая кислотасвязывается с 30S рибосомальным белком S1 и ингибирует процесс транстрансляции, который необходим для синтеза белка.
[415]. Именно мутации вгене rpsA, приводили к образованию 3% пиразинамидустойчивых изолятовM. tuberculosis. Также за осуществление устойчивости к пиразинамидуотвечают мутации в гене panD, кодирующем пантоат-β-аланин [311], и,возможно, в гене hadC (β-гидроксиацилацил дегидратаза транспортер) [527].Устойчивость к этамбутолуЭтамбутолпрепятствуетсинтезуарабиногалактановвклеткемикобактерий, тем самым нарушая формирование клеточной стенки [473].Мишенью данного антибиотика является фермент арабинозилтрансфераза,кодируемый геном embB.
У M. tuberculosis embB вместе с embC и embAорганизованы и функционируют как оперон, продуктами которого являютсятрансмембранные белки, в значительной степени схожие между собой поаминокислотной последовательности.Мутации в данном кластере генов(чаще в embB, реже в embC) и являются причиной возникновенияустойчивостикэтамбутолу[478].Наиболееклиническизначимойпредставляется мутация в кодоне 306 гена embB, которая встречается у 68%всех резистентных изолятов [466].
Однако около 35% устойчивых к28этамбутолу штаммов не несут мутаций в кластере генов embCAB, чтопозволяет предположить возможность существования других механизмовформирования устойчивости к этому препарату [270].Устойчивость к бедаквилинубедаквилин – это синтетический антибиотик, относящийся к группедиарилхинолонов (не связан с фторхинолонами). Интересной особенностьюданного препарата является то, что это первое лекарство за 40 летсуществования противотуберкулезной терапии с принципиально новоймишенью.Активностьпрепаратанаправленанаингибированиемикобактериальной АТФ-синтазы (основной мишенью была установлена Cсубъединица F1FO-АТФ-синатазы (ген atpE), а также ε субъединица F1FOАТФ-синатазы (ген atpC) [275; 286]. Препарат, после прохожденияклинических испытаний стал доступным в 2012 году и включен в списокпрепаратов 2 ряда противотуберкулезной химиотерапии [309]. Несмотря настоль не продолжительный период использования бедаквилина, ужеизвестны механизмы устойчивости к данному препарату.
Существуетдоказанный механизм устойчивости, реализующийся через мутации в генеatpE [451] и с помощью гена Rv0678, регулирующего экспрессию клеточноготранспортера MmpS5-MmpL5 [275, 343]. Стоит также отметить, чтопоявление различных мутаций в непосредственной мишени лекарстваприводит к повышению МИК бедаквилина в 8-133 раза, а появление мутацийв системе клеточного транспортера MmpS5MmpL5 всего в 2-8 раз [275, 435].1.3 Методы определения лекарственной устойчивости микобактерий.Своевременное определение лекарственной устойчивости, по мнениюподавляющего большинства фтизиатров, является важнейшим условиемназначения адекватного режима химиотерапии [3, 21, 55, 56, 66, 77, 83, 98,99, 104, 129, 130, 155, 156, 184, 192, 196, 201, 218, 219, 227, 231, 235, 236, 239,318, 488].29Существующие на сегодняшний день методы определения ЛЧ можноразделить на две группы: фенотипические (культуральные методы сиспользованием плотных и жидких питательных сред) и генотипические(молекулярно-генетические методы (МГМ).1.3.1.Культуральныеметодыопределениялекарственнойчувствительности микобактерий туберкулеза.Для определения ЛЧ МБТ в лабораторной практике обычно применяютшироко апробированные стандартные методы, наиболее распространеннымииз которых являются метод пропорций и метод абсолютных концентраций.Метод пропорций.
В микробиологических лабораториях большинства странмира используется метод пропорций, предложенный в 1963 г. Канетти идетализированный в 1985 г. Миддлбруком. Данный метод основан насравнении количества выросших колоний на среде с препаратом и на средебез препарата с различными концентрациями бактериальной суспензии. Дляэтого суспензию микобактерий, содержащую 1 мг/мл полувлажного весамикобактерий, разводят до концентрации 1х104 и 1х106. Оба разведениясуспензии засевают на питательную среду без препарата и на набор сред сразными препаратами. Штамм считается устойчивым в том случае, есличисло выросших колоний на среде с препаратом составляет более 1%.
Этодает возможность вычислить процент жизнеспособной популяции приопределеннойконцентрациипрепаратаиопределитьсоотношениеустойчивых и чувствительных особей МБТ в исследуемой культуре. ДляметодапропорцийиспользуетсямеждународнаяпитательнаясредаЛевенштейна-Йенсена. Результаты теста учитывают на 28-й день (дляустойчивых штаммов) и на 40-й день (для чувствительных штаммов) послепосева микобактериальной суспензии [837]. Метод пропорций болеетрудозатратный по сравнению с методом абсолютных концентраций. Крометого, манипуляции с разведением микобактериальной суспензии повышаютриск внутрилабораторного инфицирования персонала.30Метод абсолютных концентраций.
В лабораториях России и некоторыхдругих стран для определения ЛЧ МБТ широкое применение нашел методабсолютныхконцентрацийнаплотнойяичнойпитательнойсредеЛевенштейна-Йенсена, который официально утвержден Приказом МЗ РФ №109.ПринципметодасостоитвопределенииконцентрацииПТП,ингибирующих рост культуры МБТ при выращивании их на плотныхпитательных средах с различным содержанием ПТП [173].
Для различныхпрепаратовустановленаопределеннаяконцентрация,прикоторойнаблюдают размножение критической доли микобактериальной популяции.Эти концентрации носят название «критические». В качестве критерия ЛУиспользуют величину роста популяции МБТ на питательной среде спрепаратом в критической концентрации [172]. В большинстве случаев этотметод применяется для непрямого определения ЛЧ и позволяет исследоватьлюбое количество МБТ в диагностическом материале, поскольку дляопределения ЛУ используются штаммы МБТ, предварительно выделенныена питательных средах. Так как сроки выделения возбудителя напитательных средах составляют не менее 1 – 1,5 месяцев, результатыопределения ЛУ указанным методом обычно получают не ранее, чем через 2- 3 месяца после посева материала.
Культура считается чувствительной к тойконцентрации ПТП, которая содержится в среде, если число колониймикобактерий, выросших на пробирке с препаратом, не превышает 20, апосевная доза соответствует 10 миллионам микробных тел. Культурарасценивается как устойчивая к данной концентрации ПТП только приналичии на пробирке с этой концентрацией 20 и более колоний при обильномросте в контрольной пробирке, не содержащей ПТП [173]. К разновидностиметода абсолютных концентраций относится ускоренный нитратредуктазныйметод, разработанный в ЦНИИТ РАМН. Метод позволяет сократить срокитестирования ЛЧ МБТ к ПТП до 8 - 12 суток за счет использованиябиохимическойреакции,выявляющейферментативнуюактивность31жизнеспособных микобактерий при отсутствии видимого роста культуры.Принцип метода заключается в известной способности МБТ восстанавливатьнитраты в нитриты.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
