Н.А. Юрина, А.И. Радостина - Гистология (1135282), страница 51
Текст из файла (страница 51)
Она активно регулирует поступление веществ в клетку и их выхождение из нее. Поэтому употребляемые биологами термины «изотонический», сгипертонический» и «гипотонический» являются скорее эмпирическими, основанными на действии этих растворов на клетки и ткани. Изото ни ческий раствор — это такой распюр, в котором клетки сохраняют свой объем. Гипертонический раствор — это раствор, в котором происходит сморщивание клеток за счет выхождения из них воды. В г и п о т о н и ч е с к о м растворе происходит набухание клеток. Например, если эритроциты крови поместить в воду или в раствор очень низкой молярной концентрации, вода путем осмоса будет проникать в клетку, клетка набухает, ее оболочка может лопнуть.
Изотоническим для большинства клеток млекопитающих является 0,1б М распюр хлорида натрия (0,9%). Применяются и другие изотонические растворы. Для сохранения структуры клеток, особенно в электронной микроскопии, при фиксации материала очень важно следить за тем, чтобы используемые растворы были изотоническими. В ряде гистологических и гистохимических методов необходимыми компонентами являются нормальные растворы кислот. При приготовлении таких растворов учитывают плотность кислоты, которая зависит от концентрации.
Для получения 1 н. раствора объем кислоты, содержащий 1 г-экв, доводят в мерной колбе до 1 л, добавляя дистиллированную воду. Необходимый объем можно определить по табл. 1 — б. Буферные растворы используют для поддержания определенной концентрации водородных ионов (рН). Например, для окрашивания гликозаминогликанов соединительной ткани требуется кислая среда (низкие значения рН), при фиксации материала для электронной микроскопии — близкие к нейтральному (рН 7,3— 7,4), для выявления активности ферментов — те значения рН, при которых данные ферменты активны.
Ниже приводятся таблицы для приготовления некоторых буферных смесей (табл. 1 — 6). Продолиенне табл. 1 Конце атумом т (моска/масса) нормальность Объем, содермащий 1 г-екв (мл) Хлористоводородная кислота 36 11,64 37 12,01 38 12,38 39 12,75 40 13,14 1,1789 1,1837 1,1885 1,1932 1,1980 86,0 83,3 78,4 76,2 Азотная кислота 68 15,16 69 15,43 70 15,70 71 15,96 72 16,25 1,4048 1,4091 1,4134 1,4176 1,4218 66,0 62,7 61,6 П р я м е ч а н н е. Для нрвготоелеяня 1 н, распюра объем, указанный в 4.й колонке, доводят в мерной колбе объемом 1 л до метка, добаюню днсгнллнроюнную вощс Длн гнстологнчесюй нрактякн такая точносп счкюется достаточной.
Т а б л и ц а 2. Првпиовлевве моларимх ргитворов (во Р. Лалла, 1969) 24,0 1,0643 26,0 1,0619 27,0 96 28,0 1,0570 29,0 1,0549 1,0524 1,0498 30,0 54,8 35,28 62,59 62,27 61,95 61,64 61,33 61,03 60,73 60,16 59,90 59,63 59,37 59,11 58,85 58,59 58,32 58,08 57,85 57,63 57,41 57,19 0,9101 0,909 0,908 0,9070 0,906 0,905 0,9040 0,903 0,9Ы 0,9010 0,900 0,899 0,8980 0,897 0,896 0,895 0,8940 0,893 0,89Л) 78,0 77,0 76,0 75,1 74,2 73,3 гс,5 71,6 70,8 70,0 69,3 68,5 67,8 67,0 66,3 65,6 63,7 Т а б л и ц а 3. Првготовлевие О,М М какодилатвого буфера (РН 5,0 — 7,4) [во Г. Гайеру, 3974) 0,01 М какодилат натрия 21,4 г/л На(СН«) .А«О ЗН,О 100 мл 0,1 н.
НС( — Х' мл Дистиллированная вода до 200 мл РН 0,1а. НОО ма РН 03 н. НО, мл РН 03н. НО, мл 5,0 5,2 5,4 93,5 90,1 85,2 78,4 69,6 6,0 6,4 6,6 59,1 47,7 36,5 26,6 6,8 7,0 7,2 7,4 18,6 12,6 8,3 5,4 ' Х вЂ” число милле«игра« 0,1 н. Раег«ара НО, «старое нужно деба«ать дл«получен««у«еэеннаге значенгм РН. Т а б л и ц а 4. Праготовлевие 0,1 М фосфатвого буфера (РН 5»7-4)»0) [ио Г.
Гайеру, 3974) 0,2 М распюр Р/аН,РО» (27,58 г/л) 0,2 М распюр Р/а,ЯРО, (28,38 г/л) 0,2М 0,2М Н 02М 0,2М НаН»РО», мч Не»НРО», мл Н«Н«РО», мл Пе»НРО», м« Т а б л и ц а 5. Приготовление 0,2 М ацетат-уксусвоквглего буфера (рН 3,6 — 5,6) [ае Г. Гейеру,[974[ 0,2 М распюр ацетата натрия (16,4 г/л ацетата натрия) 0,2 М уксуснан кислота (12 мл/л уксусной кислотм, ллстность 1,060 — 1,0613) 5„7 5,8 5,9 6,0 6,1 6,2 6,3 6,4 6,5 6,6 6,7 6,8 93,5 92,0 90,0 87,7 85,0 81,5 77,5 73,5 68,5 62,5 51„0 6,5 8,0 10,0 12,3 15,0 18,5 22,5 26,5 31,5 37,1 43,5 49,0 6,9 7,0 7,1 7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 8,0 45,0 39,0 33,0 28,0 19,0 16,0 13,0 10,5 8,5 7,0 5,3 55,0 61,0 67,0 72,0 77,0 81,0 84,0 87,0 90,5 91,5 93,0 94,7 Т а б л и ц а 6. Присетевлеиие рассаереи ивовых фесеатее (ие Р.
Лилле, 1969) з рн 1 М раствор 0,1 М раствор Глава 22 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Последовательность работы та же, что и при приготовлении гистологических препаратов для исследования с помощью световой микроскопии: взятие материала, фиксация, промывка, обезвоживание, уплотнение, получение срезов, окрашивание. Однако в каждом из этих процессов имеются особенности..
ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА И ФИКСАЦИЙ При взятии материала необходимо учитывать, что его объем не должен превышать 1 ммз. Чтобы избежать посмертных изменений тканей, можно дать животному наркоз, взять материал еще у 230 30 29 28 27 26 25 24 23 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 б 5 4 3 2 20 21 22 23 24 25 26 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 0,69 0,75 0,81 0,90 0,98 1,05 1,12 1,23 1,35 1,43 1,52 1,61 1,70 1,76 1,82 1,92 2,02 2,11 2,20 2,29 2,38 2,45 2,52 2,62 2;П 2,85 3,00 3,17 3,32 1,53 1,56 1,63 1,66 1,71 1,77 1,80 1,84 1,89 1,94 2,00 2,05 2,10 2,15 2,23 2,27 2,31 2,38 2,44 2,50 2,56 2,63 2,70 2,79 3,02 3,14 3,23 3,44 живого животного и затем умертвить его, превысив дозу наркоза. В некоторых случаях материал фиксируют перфузией фиксатором органа животного, находящегося под наркозом (например, при взятии мозга).
В настоящее время все чаще используют двойную фиксацию: фиксацию в 2 — 4'/» растворе глутаральдегида (1,5 — 4 ч) и постфиксацию в растворах, содержащих четырехокись осмия (1— 2 ч).При этом глутаральдегид лучше фиксирует белки, а осмиевые фиксаторы — липиды. Для поддержания нужного значения рН фиксаторы разводят на буферных смесях„а для создания определенного осмотического давления добавляют определенные количества саха- розы.
Осмиевые фиксаторы нельзя использовать, если планируется электронно-гистохимическое исследование ферментов. В этом случае лучше использовать формальдегид, который фиксирует значительно хуже, но действует более мягко, не разрушая ферменты. Осмиевые фиксаторы. Готовить осмиевые фиксаторы необходимо не позже чем за сутки до употребления, так как четырехокись осмия (ОзО4) растворяется очень медленно. Четырехокись осмия восстанавливается на свету, поэтому ее навески (около 1 г) хранят в специальных запаянных пробирочках, завернутых в черную бумагу, а растворы — в банках из темного стекла. Посуда должна быть химически чистой.
Свежепрнготовленный раствор можно оставить в темном месте при комнатной температуре на ночь, а затем поставить в холодильник. Если осмиевый фиксатор приобретает коричневую окраску, значит он пришел в негодность. Из осмиевых фиксаторов одним из лучших является фиксатор Миллонига. Он лучше сохраняет белки и гликоген, чем другие осмиевые фиксаторы, и нередко дает хорошие результаты и без предварительной фиксации глутаральдегнда. Для приготовления фиксатора Мнллонига необходимы следующие растворы: 1) раствор А — 2,26'/я раствор ХаН РОхН О (стабилен в течение недели и более); 2) раствор Б— 2,52/ раствор ХаОН (хранить в полиэтиленовой бутылке при комнатной температуре, стабилен в течение длительного времени).„ 3) раствор  — 5,4'/~ раствор глюкозы (не стабилен); 4) раствор Г (фосфатный буфер Миллонига), для приготовления которого необходимо слить 41,5 мл раствора А и 8,5 мл раствора Б; 5) фиксатор— к 45 мл раствора Г добавить 5 мл раствора В и 0,5 г ОзО .
Концентрация водородных ионов (рН) распюра должна равняться 7,3 — 7,4. Четырехокись осмия очень токсична и работать с ней нужно только в вытяжном шкафу. Учитывая, что она не меняет рН раствора, проверку рН буфера следует проводить перед добавлением ОзО4. В замороженном виде фиксатор Миллонига хранится в течение нескольких недель. Перед замораживанием его можно разлить в химически чистые пенициллиновые флакончики в количествах, необходимых для фиксации одного кусочка. Альдегидиые фиксаторы. Рекомендуемое время фиксации 2— 4 ч. Глутаральдегидовые фиксаторы можно приготовить на какодилатном буфере или на фосфатном буфере Миллонига.
гз~ Глутар ал ьд егид на к а к од ил атно м буфере. Для его приготовления необходимо иметь запасной 0,2 М буферный раствор какодилата натрия (10,7 г какодилата натрия развести дистиллированной водой, довести конечный объем раствора до 250 мл) и 25% (или 50%) раствор специально стабилизированного раствора глутаральдегида для электронной микроскопии (продается как 25% и 50%). Оба раствора следует хранить при +4' С. Перед фиксацией материала берут 8 мл 25% (или 4 мл 50%) глутаральдегида, сливают с 25 мл 0,2 М какодилата натрия, доводят рН до 7,3 — 7,4, добавляя 1 М НС1. Затем добавляют дистиллированную воду до общего объема 50 мл. В результате получается 4% раствор глутаральдегида.
Хорошие результаты дает использование 2% раствора глутаральдегида. Для получения такого раствора нужно взять 4 мл 25% или 2 мл 50% раствора глутаральдегида (вместо указанных выше 8 или 4 мл). Глутаральдегидный фиксатор на фосфатном буфере Милл они га. Для его приготовления требуется раствор А — 2,26% раствор НаН РО„Н О, раствор Б — 2„25% раствор ХаОН н расвор  — 25% раствор глутаральдегида. Перед употреблением необходимо смешать 8 мл раствора В и 32 мл раствора А, довести рН до 7,3 — 7,4, добавляя постепенно раствор Б, и долить дистиллированной воды до общего объема 50 мл. Добавлять глюкозу не требуется, так как раствор уже является гипертоническим.
П ар а ф о р м а л ьд е гид н ы е фиксатор ы, как уже упоминалось, используются при гистохимическом исследовании ферментов на уровне электронной микроскопии. При этом нельзя пользоваться продажным 40% (точнее 37%) формальдегидом, а только химически чистым порошкообразным параформальдегидом. Для приготовления формальдегидного фиксатора на буфере Миллонига необходимо соединить растворы А и В фосфатного буфера Миллонига (см. выше) в следующем соотношении: раствора А 41,5 мл и раствора Б 8,5 мл.
Смесь следует нагреть до 60 — 80' С (в закрытом сосуде, чтобы избежать испарения). Добавить 2 г химически чистого порошкообразного параформальдепща. Встряхивать до полного растворения параформальдегида, профильтровать, охладить. Хранить фиксатор нельзя, он должен готовиться перед употреблением. Промывка осуществляется в том же буферном растворе, на котором готовится фиксатор — в 3 порциях по 5 мин. Если использована двойная фиксация, то промывают после каждого употребления фиксатора, впрочем перед дофиксацией четырехокисью осмия промывку можно не проводить. ОБЕЗВОЖИВАНИЕ И ЗАЛИВКА Для электронной микроскопии необходимо получить ультратонкие срезы (40 — 80 нм). Заливка в парафин и целлоидин для получения таких срезов не подходит, необходимы более твердые среды.
232 Поэтому материал заливают в синтетические смолы, например эпоксцдные (эпон, аралднт нли различные сочетания эпона с аралдитом). Материал заливают в жидкие эпоксидные смолы, которые затем полимеризуются и затвердевают. Обезвоживание производят в этиловом спирте возрастающей концентрации — 50/о, 60О/о, 70%, 80%, 960/о, 100О/о, 100% примерно по 10 мин в каждом. При этом не материал переносят из сосуда в сосуд, а спирт наливают в маленький флакончик (например, пенициллиновый), в котором находится материал, а затем сливают. Заливка в араадит.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
