Н.А. Юрина, А.И. Радостина - Гистология (1135282), страница 49
Текст из файла (страница 49)
Можно производить окантовку канадским бальзамом по Целлеру. Для этого срез расправляют на маленьком (18х18 мм) покровном стекле и капают на него среду для заключения (например, глицерин). Быстро переворачивают покровное стекло так, чтобы срез со средой оказался внизу, и накладывают его на большее (24х 36 мм) покровное стекло так, чтобы большее стекло со всех сторон выступало за пределы малого. Заливочная среда не должна выступать изпод малого стекла, лишнюю среду нужно отсосать поставленной вертикально фильтровальной бумагой. На чистое предметное стекло наносят 2 — 3 капли канадского бальзама и равномерно размазывают его на площади, несколько меньшей, чем площадь большего покровного стекла.
Оба прилипших друг к другу покровных стекла кладут на слой бальзама меньшим стеклом вниз. В результате среда для заключения оказывается замкнутой под меньшим покровным стеклом и окружена широкой зоной бальзама. После высыхания бальзама полученный препарат очень удобно исследовать, в том числе под иммерсией. 219 Окрашивание срезов для обзорных целей Различают методы окраски для обзорных целей, применяемые для получения общего представления о морфологии ткани или органа, и специальные, предназначенные для выявления определенных элементов клетки или ткани (например, комплекса Гольджи, митохондрий, эластических волокон соединительной ткани и т. д.). Ниже рассматриваются лишь некоторые методы окрашивания для обзорных целей.
Суть их обычно заключается в том, что при этом окрашиваются ядра и каким-то контрастным красителем — цитоплазма. Ядерные (основные) красители. Для окрашивания ядер используются гематоксилин, кармин, сафранин и другие основные красители. Существует несколько способов приготовления растворов гематокснлина. Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха. Гематоксилин Эрлиха. Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96'/О спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты.
Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематокснлин успел окислиться в гематеин, который н является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет. Его используют при окрашивании срезов гематоксилин-эозином (см. ниже).
Же лез н ы й г ем а то к силин Г ей де н г ай н аокрашивает в черный цвет не только ядра, но н митохондрии, темные диски скелетной н сердечной мышечной ткани и другие структуры. Для его приготовления 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды и оставляют созревать на срок не менее 4 нед. Перед окрашиванием срезы протравливают в течение 2 — 12 ч в 2,5'/о растворе железоаммначных квасцов. Раствор квасцов получают за счет 4-кратного разведения исходного 10% раствора, для приготовления которого используются кристаллы квасцов только фиолетового цвета. После промывания в дистиллированной воде срезы окрашивают в течение 1 — 36 ч раствором гематоксилина, разведенным вдвое по сравнению с исходным.
В зависимости от исследуемого материала можно использовать н большие разведения красителя. Окрашенный срез ополаскивают дистиллированной водой и дифференцируют под контролем микроскопа в растворе железоаммиачных квасцов. После этого срезы промывают в водопроводной воде не менее 30 мнн при частой смене воды. Железный гематоксилин Вейгерта готовят в виде двух основных растворов — раствора Вейгсрта 1 и раствора Вейгерта П. Раствор Вейгерта 1 представляет собой 1% раствор 220 гематоксилина в 90% спирте (1 г гематоксилина на 100 мл спирта).
Раствор Вейгерта 11 имеет следующий состав: официнальный раствор полуторахлористого железа 4 мл, 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,15 — 1,19) и 95 мл дисгиллированной воды. Официнальный раствор полуторахлористого железа — это 50% раствор водного хлорного железа (ГеС1,, 6Н О). Перед употреблением смешивают равные объемы основных растворов. Основные растворы хранятся 3 — 4 мес.
Смешанный раствор можно применять лишь несколько дней. Время окрашивания 1 — 5 мин. Затем следует промывка водопроводной водой. Срезы можно дифференцировать 0,1% раствором хлористоводородной кислоты в 70% спирте, после чего их тщательно промывают водопроводной водой. Железный гематоксилин Вейгерта должен окрашивать ядра в черный цвет.
Если они приобретают коричневый цвет, то это свидетельствует о порче красителя. Квасцовый кармин приготовляют, растворяя 3 — 5 г аммиачных квасцов в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, и добавляют 1 г кармина. Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют и добавляют 1 мл формалина. Время окрашивания— 0,5 — 24 ч, дифференцировка в дистиллированной воде проводится до прекращения отдачи красителя. Ядра окрашиваются в ярко-красный цвет. Окраску кармином можно проводить после импрегнации серебром или при выявлении железа.
С а ф р а н и н является прекрасным ядерным красителем, особенно для материала, фиксированного в растворах, содержащих осмий или хром. 10 г чистого сафранина или сафранина «С-ехгга» (качество красителя имеет очень большое значение) растворяют в смеси 155 мл 9б% спирта со 145 мл дистиллированной воды. Из полученного таким образом основного раствора перед употреблением берут 20 мл и добавляют 80 мл 50% спирта. Время окрашивания 24 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы дифференцируют, контролируя под микроскопом в 0,1% растворе хлористоводородной кислоты в абсолютном спирте.
Затем следует промывка абсолютным спиртом, просветление в ксилоле, заключение в бальзам. Кислые красители. Эти красители не являются избирательно цитоплазматическими. Красители для цитоплазмы подбирают таким образом, чтобы их цвет хорошо контрастировал с окраской ядер. Для докрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина. Для срезов, окрашенных кармином, используют раствор пикриновой кислоты, полученный путем разведения водой насыщенного раствора пикриновой кислоты в отношении 1:3 (при комнатной температуре в 100 мл воды растворяется примерно 1,2 г пикриновой кислоты, следовательно, для получения насыщенного раствора следует взять чуть больше этого количества пикриновой кислоты).
Время окрашивания 2 — 5 мин. Цитоплазма клеток и эритроциты красятся в желтый цвет. Методика окрашивания срезов гематоксил ил-э о з и н о м. Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженные срезы перед окрашиваннем следует обезжирить, поместив их на 20 — 30 мин или на ночь в 96'/о спирт.
Далее срезы переносят в дистиллированную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депарафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повторного использования. Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следующий: 1) срезы переносят в дистиллированную воду; 2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2 — 5 мин; 3) промывают в дистиллированной воде; 4) затем промывают в водопроводной воде 3 — 5 мин; 5) осуществляют контроль под микроскопом; б) дифференцируют 1~/о раствором хлористоводородной кислоты в 70' спирте 1 — 2 с; 7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей; 8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом); 9) промывают в дистиллированной воде; 10) 1'/о водный раствор эозина 0,5 — 1 мин„11) промывают в дистиллированной воде 1и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза; 12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам.
В спиртах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно установить на первых 2 — 3 срезах и затем все срезы данного блока окрашивать одинаково. Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими и в цитоплазме может быть синеватый фон. Методика окрашивания азур-2-эозином.
Эта методика также вполне пригодна для обзорных целей. Прогрессивный метод окрашивання азур-2-эозином довольно ненадежен, но регрессивный дает стабильные результаты. Основными растворами являются 0,1 / водный раствор азура и 0,1 / водный раствор эозина. Для приготовления рабочего раствора на 100 мл дистиллированной воды добавляют 100 капель основного раствора азура и 100 — 120 капель раствора эозина. Срезы помещают в раствор красителя на 12 — 24 ч. Затем срезы днфференцируют. Методы дифференцировки могут быть разными в зависимости от того, насколько интенсивно окрасились срезы. Дифференцировку можно проводить в подкисленной дистиллированной воде, затем промывать в чистой 2Е> дистиллированной воде, обезвоживать в спиртах, просветлять в ксилоле и заключать в бальзам.
При этом следует учесть, что в спиртах дифференцировка продолжается. Можно дифференцировать срезы прямо в 9б% спирте. Ход дифференцировки контролируют под микроскопом. Окрасив несколько срезов, можно контролировать на глаз по цвету среза, время от времени выборочно проверяя качество окраски под микроскопом. В качестве обзорной окраски можно рекомендовать также железный гематоксилин-пикрофуксин по Ван-Гизону. Методика окрашивания железным гематоксилин-пикрофуксином по Ван-Гизону.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
