Н.А. Юрина, А.И. Радостина - Гистология (1135282), страница 53
Текст из файла (страница 53)
Если царапина при этом появляется на том же месте, значит, она зависит не от зазубрины на ноже, а от чего-то твердого в самом блоке. Горизонтальная исчерченносгь (следы вибрации) на срезах может быть вызвана тем, что блок не был прочно закреплен в блокодержателе, а блокодержатель — в ультратоме, или слишком большим углом наклона ножа. Вибрация может также зависеть от несоответствия твердости блока и скорости резания: чем тверже блок, тем ниже должна быть скорость резания. Если все указанные причины отсутствуют, причину вибрации следует искать внутри или вне здания. С н я т и е с р е з о в. Ультратонкие срезы располагаются на мениске жидкости ленточкой или могут плавать отдельно.
Их вьиавливают на медную сеточку диаметром 3 мм. Срезы тканей, залитых в аралдит или эпон, часто помещают на сетки без подложки, но в некоторых случаях на сетку натягивают поддерживающую пленку — подложку. Отдельные срезы перед вылавливанием можно расположить определенным образом на поверхности жидкостис помощью ресницы, прикрепленной к концу деревянной палочки. Сеточку берут тонким пинцетом и опускают ее прямо на срезы. Одна сторона сеточки полированная„другая матовая. Какой стороной опускать сеточку на срезы — безразлично, но нужно всегда опускать одной и той же стороной — либо матовой, либо блестящей. Дело в том„что, когда объект помещают в колонку микроскопа, срезы должны находиться под переплетом сетки.
Если помнить, какой стороной кладутся сетки на срез, легко потом ориентировать сетку в держателе объекта, впрочем, срезы на сетке хорошо видны невооруженным глазом и тем более под лупой. После того как сетка коснулась срезов, они находятся в капле жидкости (10% раствор ацетона, 10% спирта или дистиллированная вода), которая пристала к сетке. Сетку перевертывают таким образом, чтобы капля оказалась сверху, и промокают нижнюю поверхность сетки фильтровальной бумагой. Срезы при этом распластываются, тесно прилегая к переплетам сетки.
Сетки со срезами обычно помещают в чистую чашку Петри, выстланную фильтровапьной бумагой. Теперь можно переходить к следующему этапу обработки срезов — их контрастированию. КОНТРАСТИРОВАНИЕ (ОКРАШИВАНИЕ) УЛЬТРАТОНКИХ СРЕЗОВ Контрастирование ультратонких срезов осуществляется с помощью пропитывания солями тяжелых металлов — свинца, вольфрама, уранилацетата, которые в разной степени взаимодействуют с различными компонентами ткани, в результате чего одни компоненты становятся более электронно-плотными, чем другие. Одним из наиболее употребительных методов является двойное контрастирование: уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу.
Для контрастирования срезов используют парафиновые пластинки с углублениями, в которые капают контрастирующий раствор и помещают сетки со срезами. О краш иванне уранилацет атом. Контрастирование ультратонких срезов на сеточках производится 2% раствором уранилацетата на 70% спирте или 1 — 2% водным раствором в течение 10 — 15 мин с последующим промыванием дистиллированной водой (срезы промывают, окуная несколько раз в дистиллированную воду). Воду удаляют, прикоснувшись обратной стороной сетки к фильтровальной бумаге. Раствор уранилацетата при комнатной температуре хранится несколько недель.
Окрашивание цитратом свинца по Рейнольд с у (о р и г и н а л ь н ы й м е т о д). Приготовление красителя: смешивают 1,38 г нитрата свинца, 1„76 г цитрата натрия — Ха (С Н О ], Н О и 30 мл дистиллированной воды. Смесь встряхивают в 50-миллилитровой колбе в течение 30 мин, чтобы весь нитрат свинца перешел в цитрат. Смесь при этом приобретает вид молока. Добавляют 8 мл 1 М раствора ХаОН и доводят объем раствора до 50 мл дистиллированной водой. Краситель устойчив при хранении до 6 мес. Время окрашнваиия в среднем 20 мин. До и после окрашиваиия сетки со срезами промывают 0,02 М раствором ХаОН, а затем дистиллированной водой.
Модифицированный метод окрашивания цитратом свинца по Рейнольдс у. К 10 мл дистиллированной воды, налитой в пробирку, добавляют 0,01 — 0,04 г цитрата свинца и 0,1 мл 10 М раствора г1аОН, закрывают пробирку и энергично встряхивают до полного растворения цитрата свинца. Очень важно использовать для приготовления красителя концентрированный раствор или гранулы едкого патра. Время окрашивания 3— 7 мин.
Окрашенные срезы промывают многократно, быстро окуная их в дистиллированную воду. Обсушивают сетки фильтровальной бумагой и высушивают в чашке Петри (для защиты от пыли). Двойное окрашивание уранилацетатом и цитратом свинца: 1) помещают сетки в 2% водный раствор уранилацетата на 15 мин. Окрашивание можно проводить при комнатной температуре или в термостате при 37'С; 2) осторожно промывают сетки 0,02 М 1ЧаОН; 3) окрашивают цитратом свинца по методу Рейнольдса при комнатной температуре 2 — 10 мин; 4) осторожно промывают срезы в 0,02 М ХаОН; 5) промывают дистиллированной водой, окуная сетки в воду„ 6) обсушивают сетки на фильтровальной бумаге; 7) высушивают сетки со срезами в защищенном от пыли месте (в чашке Петри).
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПЛЕНОК-ПОДЛОЖЕК Если материал хорошо залит и срезы при исследовании их в электронном микроскопе не расползаются и не рвутся, лучше использовать сетки без подложек, так как подложки увеличивают толщину изучаемого объекта„снижают контрастность изображения и повышают опасность загрязнения. В тех случаях, когда подложки необходимы, можно использовать в качестве подложек коллодневые или формваровые пленки. Приготовление колледиевых плевок. Готовят 0,5% раствор коллодия на амилацетате. Предметное стекло (промытое, но не обезжиренное, иначе пленку не удастся снять) погружают в раствор коллодия, дают стечь раствору на фильтровальную бумагу, вынимают и сушат в вертикальном положении 10 мин в высоком бюксе или закрытом (для защиты от пыли) биологическом стаканчике.
Затем пленку подрезают лезвием бритвы по краям, дышат на стекло и медленно опускают его в дистиллированную воду под углом примерно 30' к поверхности воды. Пленка коллодия должна отслоиться от стекла и остаться на поверхности воды. Можно попытаться получить сразу две пленки. Тогда пленку подрезают на обеих сторонах стекла, а стекло опускают вертикально.
Пленка должна быть видна только в отраженном свете и казаться серой или серебристо-серой. Золотистая пленка слишком толста. На плавающую пленку опускают сетки, слегка нажимая на каждую сетку пинцетом. Кусок неворсистой бумаги опускают на пленку и, поднимая его, извлекают пленку вместе с сетками. Бумагу кладут сетками кверху в чашку Петри, в которой она высыхает. Сетки можно снять пинцетом. Формваровые пленки готовят таким же способом, только вместо коллодия используют 0,3 — 1% раствор формвара в дихлорэтане или хлороформе. Концентрацию раствора формвара подбирают опытным путем, пока не будет получена пленка нужной толщины. Формвар должен быть достаточно свежим.
Очень важно в процессе всей работы по подготовке материала для электронной микроскопии хранить все материалы от загрязнения, прежде всего от пыли. Растворы должны быть закрытыми и достаточно часто меняться, сетки и ножи защищены от пыли. Инструменты должны быть чистыми. Если перед работой сетки необходимо очистить (это могло быть сделано и фирмой-изготовителем), их споласкивают в нескольких сменах дистиллированной воды и химически чистом ацетоне. Затем ацетон сливают, а сетки вытряхивают на лист фильтровальной бумаги и сушат в защищенном от пыли месте.
Готовые к просмотру в электронном микроскопе сетки с контрастнрованными ультратонкими срезами хранят в специальных контейнерах, где для каждой сетки имеется специальная ячейка. Глава 23 МИКРОСКОПЫ И ТЕХНИКА МИКРОСКОПИРОВАНИЯ При изучении курса гистологии и в работе лаборанта-гистолога постоянным инструментом является микроскоп. Микроскоп — это оптический прибор, с помощью которого можно видеть очень мелкие объекты в увеличенном размере. Он представляет собой двухступенчатое увеличительное устройство, в котором объект увеличивается в системе линз объектива, а затем линзой окуляра. При этом получается увеличенное обратное изображение объекта, поэтому, если изображение нужно подвинуть влево, препарат двигают вправо, если нужно рассмотреть деталь в нижней части, препарат двигают вверх.
Устройство светового микроскопа К оптическим частям микроскопа относятся объективы и окуляры. Имеются окуляры и объективы, дающие различные увеличения. В более простых микроскопах, таких как микроскоп биологический рабочий ! (МБР1), обычно имеются три объектива: объектив слабого (малого) увеличения, объектив сильного (большого) увеличения и иммерсионный объектив. На объективе слабого увеличения стоит цифра 8х (илн 10х), что означает, что он увеличивает в 8 или 10 раз, на объективе сильного увеличение — 40х и на иммерсионном объективе — 90х. В более сложных микроскопах, используемых для научных исследований, могут быть, кроме того, объективы Зх, 20х, ббх. Объективы Зх, 8х, 10х, 20х и 40х— сухие объективы. Это значит, что между объективом и покровным стеклом препарата находится воздух. Объективы 60х и 90х иммерсионные.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
