Н.А. Юрина, А.И. Радостина - Гистология (1135282), страница 48

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 48)

Тиосульфат натрия готовят в виде 0,25'/о раствора. Предметные стекла складывают попарно так, чтобы срезы были обращены к поверхности, и помещают в стаканчик или бюкс под углом друг к другу. Для одновременной обработки большего количества срезов используются стеклянные кюветы, в которых можно разместить сразу 10 — 20 стекол. При депарафинировании срезы держат в ксилоле 1 и П, а также в спиртах по 2 — 3 мин, в йодистом спирте и тиосульфате натрия 10 мин.

Далее следует промывка в дистиллированной воде (после тиосульфата натрия — в нескольких порциях воды). Целлоидин из целлоидиновых срезов перед окрашиванием, как правило, не удаляется, но в случае необходимости он легко может быть растворен ацетоном, спиртом с эфиром или гвоздичным маслом. При этом целлоидиновые срезы наклеивают на предметное стекло, покрытое белком с глицерином, плотно прижимают смоченной в 70% спирте фильтровальной бумагой и заливают гвоздичным маслом. Затем дают маслу стечь и переносят срезы в ацетон, спирт с эфиром или абсолютный спирт, после чего их помещают в 70'/~ спирт и дистиллированную воду. Красители и их приготовление.

Красители различают основные, кислые и нейтральные. Основной к р а с и тел ь представляет собой красящее основание или его соль, кислый красит е л ь — красящую кислоту или ее соль. При соединении водных растворов кислого и основного красителей может образоваться соединение красящей кислоты с красящим основанием — н е й тральный краситель. Структуры, красящиеся основными красителями, имеют кислую реакцию (например, содержат ДНК или РНК) и называют б а з оф и л ь н ы и и, т.

е. любящими основные краски. К базофильным структурам в клетке относится ядро. Структуры, красящиеся кислыми красителями, называются а ц и д о ф и л ь н ы м и. Цито- плазма клеток чаще всего бывает ацидофильной. Если срезы оставляют в красителе только до тех пор, когда они будут достаточно окрашены, то такой метод окрашивания называется прогрессивным.

Регрессивным методом о к рашн в а н ия называется такой метод, когда срез сначала г~е окрашивается чересчур интенсивно, а затем избыток краски удаляется путем отмывания (дифференцировки). Общие правила окрашивания: 1) перед применением красители следует профильтровать; 2) при окрашивании в течение длительного времени красителями низкой концентрации достигаются лучшие результаты, чем при окраске в течение короткого времени красителями высокой концентрации; 3) более четкая окраска обычно достигается использованием регрессивных методов, когда фон убирается дифференцировкой; 4) после дифференцировки необходимо тщательно отмыть срез, иначе осгаток дифференцирующего вещества его быстро обесцветнт. Просветление и заключение срезов.

Окрашенный препарат сначала обезвоживают„проводя по спиртам возрасгающей концентрации до абсолютного, затем помещают в ксилол или бензол, в результате чего срезы и ро с в е тл я ются,т. е. становятсяоднородными в отношении преломления света — прозрачными. Обезвоживания в абсолютном спирте иногда недостаточно, так как абсолюгньш спирт притягивает влагу из воздуха.

Если срезы недостаточно обезвожены, то после помещения в ксилол они остаются мутными„и это в дальнейшем помешает их микроскопированию. В этом случае после обезвоживания в 96зй спирте срез помещают в карбол-ксилол, в котором он полносп,ю обезвоживается и частично просветляется, затем переносят в ксилол. Для приготовления карбол-ксилола кристаллический фенол расплавляют в термостате при температуре 56'С и смешивают с ксилолом в отношении 1:4.

Карбол-ксилол разрушает некоторые красители, поэтому срезы в нем следует держать не более 2 — 3 мин, а затем тщательно промывать ксилолом. Если препарат окрашен на жир, то его нельзя проводить через спирты и просветлять в ксилоле, так как эти вещества являются растворителями жира. В этом случае срезы просветляют в глицерине или растворе ацетата калия и заключают в эти же среды или в глицерин-желатин (см. ниже).

Для обезвоживания и просветления срезов, наклеенных на стекло, используют батарею высоких бюксов или биологических стаканчиков, заполненных 70%, 96'l~ и абсолютным спиртами, а также ксилолом. Целлоидиновые срезы обыкновенно обезвоживают и просветляют ненаклеенными, проводя их с помощью препаровальной иглы или стеклянной палочки с загнутым под прямым углом концом через батарею низких бюксов, заполненных теми же растворами.

Для обезвоживания целлоидиновых срезов лучше пользоваться карбол-ксилолом, так как под влиянием абсолютного спирта они становятся слишком мягкими. Заключение гистологических срезов производят с целью получения из них пригодных для микроскопирования н хранения препаратов. Для этой цели чаще всего используют ка наде к и й бал ьз а м, разведенный в ксилоле. Кусочки канадского бальзама заливают ксилолом и сгавят в термостат. Кснлол добавляют в таком ггг количестве, чтобы бальзам получился жидким и его можно было профильтровать. Затем бальзам оставляют в открытой склянке в вытяжном шкафу до тех пор, пока ксилол испарится настолько, что бальзам приобретает консистенцию жидкого меда. Если бальзам хранят в специальной баночке с притертым колпачком, края колпачка смазывают вазелиновым маслом„чтобы он не присох к баночке. Канадский бальзам имеет кислую реакцию, что вредно отражается на препаратах, окрашенньзх некоторыми красителями.

Для нейтрализации куски канадского бальзама разжижают путем нагревания и добавляют к нему немного порошка карбоната калия. Затем, помешивая, нагревают их в песочной бане до тех пор, пока капля, нанесенная на предметное стекло, не будет застывать в твердую, как стекло, массу (способ Колюччи). При з а к л ю ч е н и и ненаклеенных целлоидиновых срезов после просветления в ксилоле их вылавливают на предметное стекло. При этом предметное стекло опускают в ксилол, подводят под срез, расплавленный срез придерживают за верхний край препаровальной иглой и вытаскивают вместе со стеклом. Если срез вытащить из ксилола, а потом пытаться расправить его на стекле„он может быть безнадежно измят. Если срез наклеен на предметное стекло (например, парафиновые срезы), стекло со срезом после просветления извлекают из ксилола и обтирают с обратной стороны и по краям сухой чистой тряпочкой.

На срез наносят каплю канадского бальзама и накрывают его покровным стеклом. Чтобы избежать попадания под покровное стекло пузырьков воздуха, необходимо соблюдать следующие правила: каплю бальзама наносят на край среза, затем покровное стекло ставят у края капли на предметное стекло под углом в 45', при этом бальзам растекается по краю покровного стекла (рис. 81). Свободный край покровного стекла придерживают препаровальной иглой и медленно опускают покров- 21 В Рис.

81. Техника заключения срезов (по Д. Кисели, 1962). ное стекло на срез. Бальзам при этом вытесняет воздух и растекается тонким слоем под покровным стеклом. Если бальзама было взято недостаточно и между стеклами остался воздух, можно нанести каплю бальзама у того края покровного стекла, где имеется воздух; бальзам затечет под стекло. Заключенные препараты оставляют для подсушивания в горизонтальном положении на лотках в течение 1 — 2 сут.

После этого их можно поместить вертикально в специальные коробки для гистологических препаратов. Препараты, окрашенные на жир, заключают в глицерин, глицерин-желатину или в раствор ацетата калия. Для заключения препаратов, окрашенных на жир суданом, глицерин насыщают при нагревании хлоридом кадмия.

Получающуюся после охлаждения сиропообразную жидкость используют в качестве среды для заключения. Для приготовления глицерин-желатины 7 г желатины оставляют набухать в 42 мл дистиллированной воды в течение нескольких часов, затем прибавляют 50 мл глицерина и 0,6 г кристаллов фенола, нагревают на водяной бане 10 — 15 мин при помешивании, фильтруют через стеклянную вату и остужают. Для заключения небольшой кусочек застывшей массы кладут на покровное стекло, осторожно нагревают до расплавления, быстро переворачивают стекло и накладывают висячую каплю на препарат, где масса быстро растекается и застывает.

Можно расплавить глицерин-желатину в водяной бане, стеклянной палочкой нанести на срез несколько капель и быстро накрыть покровным стеклом. Вместо глицерина используют насыщенный водный раствор ацетата калия. Срезы, заключенные в глицерин или в ацетат калия, должны быть о к а н т о в а н ы, чтобы предотвратить испарение среды. Для этого кисточкой, смоченной в горячем парафине, проводят по краям покрытого стекла так, чтобы получился кант толщиной 3 — 4 мм.

Характеристики

Список файлов книги