Н.А. Юрина, А.И. Радостина - Гистология (1135282), страница 47
Текст из файла (страница 47)
Нож должен идти свободно. Давить на него не следует. Качество заточки ножа контролируют под микроскопом. После белыийского камня точат на белом камне— 2!2 арканзасе. Время точки ножа зависит от его состояния и твердости стали. Если на ноже есть глубокие зазубрины, точка может занимать несколько часов, при хорошем состоянии ножа — 20 — 30 мин. После точки на камне нож правят на ремне. При этом пользуются широким ремнем с войлочной прокладкой, натянутой на деревянную колодку. Нож при правке ведется обушком вперед и переворачивается также через обушок, чтобы не испортить режущий край.
Приготовление парафиновых и целлоидинпвых срезов. Блок фиксируют в объектодержателе так, чтобы длинная ось блока располагалась вдоль длинной оси микротома, а поверхность блока горизонтальной. Очень важна правильная установка ножа. Оптимальным углом наклона ножа считается такой, когда плоскость фасетки совпадает с плоскостью среза. На практике угол наклона ножа обычно несколько больше оптимального. Если угол наклона ножа слишком велик, материал будет крошиться, если слишком мал, нож будет 1 — 2 раза проскальзывать над блоком, а потом срезать толстый срез.
Парафиновые блоки режут прямым ножом, целлоидиновые— плосковогнутым. При резке парафнновых блоков нож устанавливают перпендикулярно оси микротома или слегка под углом. В последнем случае нельзя получить серийных срезов, но зато очень плотные и трудно режущиеся объекты режутся легче. При резке целлоидиновых срезов нож устанавливают под углом.
Когда нож установлен, к нему осторожно подводят блокодержатель с блоком и одновременно придвигают нож к блоку. Подачу объектодержателя осуществляют с помощью кремальеры, расположенной в основании объектодержателя, либо рукой, толкая санки объектодержателя вдоль наклонных рельсов. Когда блок и нож сближены, проверяют горизонтальность верхней поверхности блока, которая не должна доходить до лезвия ножа на 0,5 — 1 мм.
После этого устанавливают микрометрическую шкалу на получение толстых срезов (30 мкм) и движением салазок ножа начинают подавать блок вверх до тех пор, пока не начинают получаться первые полные срезы, затем микрометрическую шкалу следует установить на необходимую толщину срезов. Парафиновые срезы делают толщиной 7 — 10 мкм. При очень хорошо залитом материале и хорошо наточенном ноже можно получить срезы толщиной 3 — 5 мкм. Толщина целлондиновых срезов обычно составляет 12 — 15 мкм. Парафиновые срезы режут сухим ножом. Прн резке целлоидиновых срезов поверхность ножа и поверхность блока постоянно смачивают 70% спиртом. Полученные парафиновые срезы осторожно, не прикасаясь к режущему краю ножа, снимают влажной кисточкой или препаровальной иглой н помещают в чашку с теплой водой илн сразу наклеивают на предметное стекло (см.
ниже). Если блоки небольшие и прямоугольные, при поперечном положении ножа при резке из срезов получают ленточки (серии). Отдельные срезы не снимают с ножа. Края их прикреплены друг к другу, и они располагаются полоской друг за другом. Эту полоску снимают целиком для шз дальнейшей обработки. Парафиновые срезы всегда слегка сморщены и имеют складки. Эти морщинки и складки необходимо расправить, либо поместив срезы на поверхность теплой (не горячей, чтобы не расплавился парафин!) дистиллированной воды, либо в процессе наклеивания на предметное стекло.
Наклеивают парафиновые срезы на чистые обезжиренные предметные стекла, смазанные белком с глицерином. Для приготовления последнего свежий яичный белок взбивают шпателем и фильтруют через смоченный дистиллированной водой бумажный фильтр. К профильтрованному белку добавляют равный объем глицерина, смешивают и кладут для предупреждения загнивания 2 — 3 кусочка тнмола величиной с зернышко пшеницы.
В закрытой склянке белок с глицерином хранится длительное время. Маленькую капельку белка с глицерином наносят на предметное стекло и пальцем размазывают тонким слоем по стеклу. Если срезы были помещены в чашку с дистиллированной водой, белок на стекле коагулируют, подержав стекло над спиртовкой белком вверх. Затем расправленный срез при помощи кисточки вылавливают из воды и переносят на стекло. Осторожно наклоняя предметное стекло, дают воде стечь и затем на 12 — 24 ч стекло переносят в термостат с температурой 37'С. Более употребителен другой способ наклеивания и расправления парафиновых срезов.
При этом на смазанное белком с глицерином предметное стекло наносят несколько капель дистиллированной воды, на которую прямо с микротомного ножа переносят срезы. Затем стекло осторожно подогревают над спиртовкой до полного расправления срезов, при этом следует избегать расплавления парафина, так как в противном случае материал портится. Излишнюю воду осторожно удаляют фильтровальной бумагой, и стекла оставляют для просушки при комнатной температуре или в термостате при 37'С.
Вместо спиртовки для расправления парафиновых срезов можно использовать специальный электрический прибор «Приспособление для сушки и расправления парафиновых срезов», представляющий собой подогреваемый до нужной температуры столик. На покрытое белком стекло наносят несколько капель дистиллированной воды, кладут стекла на столик и переносят на него срез. После расправления среза лишнюю воду удаляют фильтровальной бумагой и оставляют стекло с наклеенным срезом на столике для досушивания.
Целлондиновые срезы переносят с ножа в низкий бюкс с 70'/» спиртом и в дальнейшем окрашивают без наклеивания на предметное стекло, помещая срезы с помощью препаровальной иглы с загнутым концом или стеклянным крючком в соответсгвующие реактивы. Правила резки парафиновых блоков и некоторые способы устранения возможных недостатков заключаются в следующем. Передвигать салазки ножа нужно равномерно, не нажимая на них.
Если материал крошится, то это может зависеть от слишком 214 большого наклона ножа или от слишком тугоплавкого парафина и низкой температуры окружающей среды. Правильный угол наклона можно найти эмпирически, попробовав разные углы наклона. Устранить влияние низкой температуры можно, подышав на блок или пристроив настольную лампу таким образом, чтобы она светила на блок и слегка его согревала. Если залитый материал отделяется от парафина или выпадает из него, причина может заключаться в недостаточном удалении из материала спирта или в использовании при заливке слегка охлажденного парафина.
В любом случае материал нужно поместить обратно в промежуточную среду (ксилол, хлороформ) и затем повторить заливку. Если срезы разрываются или покрываются бороздками, это означает, что на ноже есть зазубрины. Можно попробовать слегка подвинуть нож, так чтобы на блок приходился другой его участок.
Если это не поможет, необходимо точить нож заново. Закручивание срезов и нх прилипание к ножу встречаются при очень мягком парафине и высокой температуре окружающей среды. В этом случае перед резкой можно положить блок в холодильник, а во время резки время от времени класть на него кусочек льда, завернутый в марлю. Причиной того, что не каждый срез, а лишь каждый второй годен для исследования, может быть неправильный угол наклона ножа. Возможно также, что срезы слишком тонки для данного метода или качества заливки. В этом случае нужно на несколько микрометров увеличить толщину среза. Если блок плохо режется, нож подскакивает на поверхности блока и толщина срезов неровная, это объясняется чрезмерным уплотнением материала при фиксации.
Исправить этот недостаток нельзя, но можно попробовать подышать на блок и поставить микротомный нож не перпендикулярно, а под углом. Серии срезов при этом получить нельзя, но отдельные срезы режутся лучше. В сухую погоду срезы электризуются и сильно прилипают к ножу. Это можно предотвратить, подьш~ав на нож перед резанием. Марки ро в к а стекол обычно следует за резанием блоков. Для этого при наклеивании срезов на блок одни конец стекла оставляют свободным. Надпись на стекло можно наносить с помощью алмазного отметчика, но чаще это делается тушью.
Так как тушь размазывается или стирается, следует ее наносить на смазанный белком и высушенный конец стекла. Затем этот конец нагревают над спиртовкой. Надпись при этом фиксируется и в дальнейшем не стирается. Окрашивание и заключение срезов Окрашивание срезов обычно требует предварительной подго- товки. Для парафиновых срезов такой подготовкой является удале- ние парафина — д е и а р а ф и н и р о в а н и е.
Батарея для депара- 215 финирования включает высокие бюксы или биологические стаканчики, содержащие две порции ксилола — ксилол 1, ксилол П, абсолютный спирт„96'/ спирт, 70'/о спирт и стаканчик для воды. Если в дальнейшем используется спиртовой краситель, то срезы в него переносятся прямо из спирта, минуя воду.
Если материал был фиксирован сулемовым фиксатором (жидкость Ценкера), то в батарею нужно включить для удаления сулемы бюксы с йодистым спиртом и тиосульфатом натрия. Иодистый спирт готовят, добавляя к 70% спирту несколько миллилитров раствора йод-йодида калия. Для приготовления основного раствора йод-йодида калия в 10 мл дистиллированной воды растворяют 3 г йодида калия (К1), в 90 мл абсолютного спирта растворяют 2 г йода и затем смешивают оба раствора.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
