Д.Г. Кнорре, Л.Ф. Крылова, В.С. Музыкантов - Физическая химия (1134491), страница 73
Текст из файла (страница 73)
Как видно, он определяется свойствами седиментирующих частиц и растворителя, а также параметрами состояния системы, в первую очередь температурой, которая влияет на вязкость растворителя и тем самым, согласно (8.4), на коэффициент поступательного трения. Единицей измерения константы седиментации может служить секунда. Однако принято приводить эти константы в единицах Сведберга (по имени ученого, предложившего метод ультрацентрифугирования и создавшего первые ультрацентрифуги), составляющих 1О-1з с и обозначаемых Св (5).
Константы седнментации легко определяются экспериментально с помощью специальных аналитических центрифуг. В роторах зтнх центрифуг имеются небольшие вертикальные прорези, в которые помещены кюветы, заполненные раствором исследуемого полимера. Специальные оптические системы позволяют фотографировать границу седиментации, например, путем регистрации распределения оптической плотности вдоль кюветы, если наблюдение ведется за веществом, имеющим характерное поглощение в некоторой области видимого или ультрафиолетового спектра. Так как о=бг/пг н а=оРг, то с учетом (18.15) соотношение (18.14) может быть записано в виде дг/бГ = зеРг, (18.16) где г — расстояние границы седиментации до оси ротора. Интегрирование приводит к соотношению ! п г =злат/+ сопз1. Фиксируя г в определенные моменты времени после установления постоянной скорости вращения ротора, нетрудно по наклону прямой линии, получаемой в координатах 1п г, 1, найти константу седи- (18.17) нз которого следует, что, зная константу седиментации и коэффициент диффузии, нетрудно определить массу, а следовательно, и молекулярную массу биополимера по уравнению ецт вП вЂ” Ут.гз) ' называемому соотношением Сведберга.
Если раствор, содержащий смесь полимеров с разными константами седиментации, нанестн в центрифужной пробирке тонким слоем (зоной) на раствор более высокой плотности (в биохимии для этой цели используют раствор сахаровы), то в результате седиментации произойдет разделение молекул по их константам седиментации. В идеальном случае каждый из полимеров образует свою зону. После остановки ротора можно начать отсасывать содержимое пробирки по каплям в разные приемные пробирки и механически разделить образовавшиеся зоны и тем самым содержащиеся в них вещества.
Поэтому седнментация является широко используемым методом разделения биополимеров. Для этих экспериментов необходимо пользоваться бакет-роторами, так как иначе из-за изменения направления поля при разгонке ротора может размыться исходный нанесенный слой раствора, а при остановке ротора дополнительно размоются образовавшиеся зоны разделенных биополимеров. Описанный выше способ разделения высокомолекулярных соединений и определения их молекулярных масс называется методом скорости седиментации, так как в его основе лежит различие скорости движения частиц, которая определяется массой частиц.
Наряду с этим существует другой способ разделения с помощью ультрацентрифугирования, называемый методом седиментационного равновесия; основанный на различии в распределении частиц с разной массой в поле тяжести или в центробежном поле в условиях равновесия. При седиментации возникает поток растворенного вещества в направлении от оси ротора. Как только из верхних (по отношению к направлению поля) слоев вещества уйдут молекулы полимера, (18.18) ментацни. В связи с этим в биохимии часто характеризуют большие молекулы или надмолекулярные образования по величинам констант седиментации (например, 58 РНК, рнбосомная 405 субъедииица и т. п.).
Естественно, что прн этом имеются в виду величины, относящиеся к определенной температуре и определенному растворителю, обычно к воде. Замена 1 через коэффициент диффузии с помощью соотношения Эйнштейна (18.3) приводит (18.15) к выражению м1) П вЂ” ~'т~0з) зт образуется резкая граница раздела между той частью раствора, из которой молекулы еще не ушли, и той, где их уже не осталось. Естественно, при этом начинается встречная диффузия.
По мере того как бвополнмер начинает концентрироваться в нижних слоях раствора, поток диффузии усиливается и в конечном итоге потоки седиментации и диффузии полностью уравновешивают друг друга. Поток седиментации, согласно (18.2) и (18.16), У,=-со=гзезг, а поток диффузии lа —— П(дс бг). Подставляя в равенство потоков выражение (18.15) для константы седиментации, приходим к соотношению дс/Ф Рл ( 1 1 удзц) иГ с(КТ откуда б (п с~бг=т Рг(1 — К„сот КТ (18,19) Й 1пс/бЬ=— КТ и соответственно с=свекр( ), (18.21) и, следовательно, с=с,ехр( — т з(1 — $/„,р,)(ге~ — гз)АКТ] (18.20) Это соотношение описывает распределение концентраций частиц вдоль оси пробирки при установлении равенства встречных потоков диффузии и седиментации, т.
е. при седиментационном равновесии. Нетрудно видеть„ что, измеряя концентрацию исследуемого вещества вдоль ячейки после установления равновесия (это можно сделать в аналитической ультрацентрифуге), легко определить молекулярную массу полимера. Действительно, из (18.20) следует, что если концентрация исследуемого полимера в точках, находящихся на расстоянии г1 и гз от оси ротора, равна соответственно с1 и сь то от ы (сз/е1) аР (г — гз) (! — и тз) Соотношение (18.20) может быть использовано для вывода барометрического ураннения, описывающего распределение плотности атмосферы в поле земного тяготения. Для этого нужно заменить центробежное ускорение вг' на ускорение силы тяжести я и исключить множитель (1 — Ртхрз), поскольку средой для молекул Из и 0з, из которых состоит воздух, является вакуум, т.
е. рь=0. В этом случае где !т — высота над уровнем земли. Заметим попутно, что гнут есть потенциальная энергия молекул с массой пт в поле земного тяготения и следовательно, (18.20), как и (18.21), является прямым следствием распределения Больцмана (1.30). При выводе (18.20) была использована формула (18.17)„выражающая константу седиментации через коэффициент диффузия, а следовательно, и соотношение Эйнштейна (!8.3). Совпадение (!8.21) с результатом, непосредственно вытекающим из распределения Больцмана, может рассматриваться как подтверждение правильности несколько формализованного вывода соотношения Эйнштейна, приведенного нами в $18.1.
$ 46.4. Хроматография Разделение веществ с помощью электрофореза или седиментапии основано на различии в скоростях направленного перемещения частиц растворенных веществ относительно неподвижного растворителя под действием соответственно электростатического и центробежного полей. В обоих случаях разделение происходит в пределах одной фазы, т. е. в гомогенной системе. Гетерогенную систему можно сконструировать таким образом, что при принудительном перемещении жидкого раствора или газа (подвижной фазы) относительно неподвижной твердой фазы некоторые компоненты будут обратимо задерживаться твердой фазой, например, путем физической адсорбции.
В результате этого часть времени они не будут перемещаться вместе с подвижной фазой, т. е. средняя скорость их перемещения относительно неподвижной фазы будет меньше, чем для основной массы подвижной фазы. Естественно, что при перемещении в такой системе слоя (зоны) раствора, содержащего смесь компонентов, вещества, имеющие разные средние скорости перемещения будут разделяться, образуя отдельные зоны. Такой способ разделения веществ получил название хрома» гогра4пи '.
Хроматография является наиболее универсальным и поэтому важнейшим из всех методов разделения сложных многокомпонентных смесей. Этим обусловлена решающая роль, которую этот метод сыграл в химических исследованиях объектов живой природы„т. е. в биохимии, так как живые организмы состоят нз тысяч различных биологических полимеров и низкомолекулярных органических соединений различной степени сложности.
«Терман «хроматогоафня» не имеет отношения н физической н хнмнчесх й сущности метода. Происхождение его чисто нсторнчесное. В 1902 г. М. С. Цвет, пропуская смесь окрашенных веществ через нолонну с адсорбен. том, впервые получил зффент хромзтографнчесного разделенна, аыразнвшнйся в появления нескольких окрашенных зон, перемещавшихся относнтельнс полонин с разнымн сноростямн. Термин «хроматография» в переводе с греческого означает «цветопнсанне». Хроматографические процедуры чрезвычайно многообразны. Они классифицируются в зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы (жидкостная и газовая хроматография), от физико-химического принципа, лежащего в основе разделения веществ между подвижной и неподвижной фазами (адсорбцнонная, распределительная, иоиообмеиная н гель-хроматография), от аипаратурного оформления (колоночная и плоскостная хроматография), от решаемой задачи (аналитическая и препаративная хроматография).
Газовая кроматозрафия используется для разделения смесей газов или паров летучих жидкостей и твердых тел. Разделяемая смесь вводится в систему, представляющую собой трубку, заполненную неподвижной фазой, и затем перемещается с помощью тока газа-носителя. При жидкостной хроматографии в систему вводится раствор, содержащий разделяемые компоненты, и перемещение их вдоль неподвижной фазы осуществляется вместе с током жидкости (элюента), пропускаемой через неподвижную фазу. Адсорбционная хроллатографиц как следует из названия, основана на обратимой адсорбции разделяемых компонентов неподвижной фазой.
Поскольку адсорбция может проходить как из жидкости, так и из газа, то возможны как газовая, так и жидкостная адсорбциониая хроматография. Ригкредсяитеяьная хроматография основана на распределении вещества между подвижной жидкой или газовой фазой и неподвижной жидкой фазой, закрепленной на твердой фазе (носитель) путем полимолекулярной адсорбции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
