Lenindzher Основы биохимии т.3 (1128697), страница 74
Текст из файла (страница 74)
29.27); в противном случае нельзя ожидать, что встроенный в реципиентную клетку чужеродный ген обязательно будет транскрибироваться и транслироваться. Чтобы обеспечить транскрипцию астро«нного гена, часто приходится помещать этот ген в участок ДНК плазмиды или фага )„расположенный следом за промотор-операторной областью. Например, ген можно встроить в участок ДНК Е.
со)ь содержащий (пс-оперон, так, чтобы этот ген следовал за промотор-операторной областью этого оперона (разд. 29-27). Если поместить клетки Е. сей, несущие такую рекомбинаатную ДНК, в среду с лактозой, но без глюкозы, то встроенный ген будет транскрибироваться и транслироваться вместе с участком ДНК (пс-оперона, расположенным между оператором и встроенным геном.
988 ЧАСТЬ Щ. МЕХАНИЗМЪ| ПЕРЕДАЧИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАПИИ Этот подход был использован при клонировании гена соматастатина — пептидного гормона (14 аминокислотных остатков) из гипоталамуса, регулирующего секрецию инсулина, глюкагона и ~армана роста. Ген соматостатина был в этом случае синтезирован химически и присоединен к концу гена (3-галактозидазы. Два связанных между собой гена были встроены в плазмиду Е.
сей, и полученная рекомбинантная плаэмида была введена в клетки Е. со)1 В результате такие клетки синтезировали большие количества гибридного белка, состоящего из ковалентно соединенных друг с другом (3-галактозидазы и соматостатина. Такая молекула, представлающая собой п|брил собственного белка Е. сей и белка позвоночного организма, называется химерным белком. Гибрид 0-галактозидазы и соматостатнна расщепляли по пептидной связи, соединяющей два белка, что приводило к освобождению обладающего биологической активностью соматостатина. 20.19.
Мнопю гены уже клоннрованы в различных клетках-хозяевах С помощью методов, подобных описанным выше, в клетках Е. соб было проклонировано большое число разных генов. Во многих случаях новые гены зкспрессировались в форме специфических белков или соответствующих мРНК, В одном из вариантов клонирования в нормальные клетки Е. сай были введены добавочные копии одного из генов Е. сей. В результате такие клетки синтезировали большое число дополнительных копий продукта этого гена. В другом варианте в клетках Е. сой были успешно проклонированы гены, выделенные из различных эукариотических организмов. Среди них можно назвать гены инсулина, гипофизарного гормона роста (соматотропина), а- и (3-глобинов, РРНК, соматостатина и овальбумина.
Была осуществлена и обратная рекомбинация: бактериальные гены были введены в |.сном ряда эукариотических клеток. Например, ген (3-галактозидазы иэ Е. сей (разд. 29-23) был внедрен в растущие в культуре клетки мыши. Особенно интересный случай представляет введение гена Е. со)б кодирующего фермент гилоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазу (Разд. 22.19), в культуру клеток соединительной ткани, взятой у людей с сюшромом Леша — Найхана (разд.
22.19), при котором этот фермент генетически поврежден. Встроенный ген Е. сой экспрессировался с образованием бактериального фермента. Таким образом, генетический дефект клеток человека удалось исправить в лабораторных условиях с помощью введения соответствующего бактериального гена. Эукариотнческие гены одних видов были также клонированы и экспрессировались в клетках других видов.
Например, ген, кодирующий а-цепь гемоглобина кролика, был введен в растущие в культуре мышиные клетки и экспрессировался а них. Внедрение чужеродного гена в зукариотические клетки не всегда, однако, сопровождается его транскрипцией и трансляцией с образованием активного белка.
Регуляция экспрессии генов у эукариот пока еще мало изучена (раза. 29.22), во время написания этой книги проводится большое число исследований по выяснению условий экспрессии рекомбинантных генов в эукариотических клетках. 30.20. Рекомбинаитные ДНК и клонирование генов открыли новые направлении генетических исследований В популярной литературе уделяется много внимания возможному практическому использованию рекомбинантных ДНК, однако не меньшее, а может быть„ и большее значение имеет то, что клонирование генов открыло новые возможности решения многих фундаментальных проблем молекулярной генетики, казалось бы не разрешимых с помощью старых методов.
Теперь появилась возможность вьшелять и получать в большом количестве фактически любой ген для того, чтобы изучать его нуклеотидную последовательность, а также после- ГЛ. ЗО. РЕКОМБИНАЦИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ 989 довательность мРНК и белка, кодируемых этим геном. Стало доступным более прямое картирование генов в хромосомах. Особенно важное значение имеет выделение, клонирование и анализ разнообразных сигнальных и регуляторных учаспюв ДНК, таких, как Ьгены, промоторы и операторы. Открылись также возможности изучения нуклеотидных послеловательностей и функции интронов в структурных генах эукариот. В настоящее время с помощью методов клонирования исследуется механизм амплификации генов, т.е.
синтеза большого числа копий какого-то одного гена,происходящего в раннем эмбриогенеэе. Эти же методы применяются при анализе различных генов позвоночных, которые соединяются с образованием ДНК, кодирующей легкие и тяжелые цепи антител. Более доступной стала также идентификация регуляторньж механизмов, осуществляющих репрессию н дерепрессню специфических генов в эукариотическнх хромосомах. В решении всех этих задач использование рекомбинантных ДНК и методы клонирования играли и будут играть ведущую роль. 30.21. Исследование рекомбинантных ДНК имеет важное праизжчесиое зиачеиие Клонирование рекомбинантных генов н их экспрессия с образованием белковых продуктов клетками Е.
соб и дрожжей, которые можно вырастить в огромных количествах, позволяют осуществить промышленное производство многих полезных белков, коэорые другими способами получить в больших масппабах очень трудно. Перспективы использования рекомбннантных ДНК привели к возникновению новой ветви молекулярной биологии — генетической инженерии.
Простым примером может служить бактериальный фермент ДНК-лигаза, который оказался столь полезным в исследованиях по биохимии генов. Этот фермент вырабатывается в большом количестве клетками Е. сой, в которые введено много дополнительных копий гена ДНК- лигазы. Продукция ДНК-лнгазы такими клетками в несколько сот раз превышает продукцию нормальных клеток. Клонированием в Е. сой и в дрожжах дополнительных копий генов можно получить очень большие количества многих других ферментов, используемых в промышленности.
Еще олин пример постижений генетической инженерии — это введение в обычную безвредную бактерию генов, способных окислять углеводоролы нефти; такая бактерия может быть использована при очистке нефтяных разливов. Были клонированы гены ряда белков, необходимых в медицине. Нужный для лечения диабета инсулин в настоящее время получают из поджелудочной железы забитых на бойне животных. Хотя такой инсулин удовлетворяет сегодняшние потребности в этом препарате,тем не менее в связи с увеличением случаев заболевания сахарным диабетом, которому в США подвержено более 57,' населения, в какой-то моменэ. спрос может превысить предложение. Кроме того, инсулин забиваемых на бойнях животных не идентичен по своей аминокнслотпой последовательности инсулину человека, и потому для некоторых людей он неэффективен и даже непереносим.
Недавно удалось заставить Е. сой синтезировать инсулин человека, введя в нее соответствующий ген. Полученный таким способом синтетический инсулин человека уже применяется при лечении диабета. Схолным образом благодаря рекомбинантным ДНК стало возможным использование в лечебной практике гипофизарного гормона роста (соматотропинай ранее недоступного для медицинских целей.
Это важно потому, что гормон роста животных из-за различий в аминокнслотной последовательности соматотропина человека и животных неэффективен при лечении карлякояости человека. В клетках, несущих соответствующие клонированные гены, можно также с высоким выходом получать большое количество разнообразных белков, полезных в сельском хозяйстве. Например„с помощью методов генетической инженерии была создана новая высокоэффективная 990 члсть 1ц мьхлнизмы пцгьдлчи гпнцтичнской инвогмлции вакцина против ящура крупного рогатого скота, овец и свиней.
Это вирусное заболевание неизлечимо, а заболевшие животные оказываются непригодными к пище. В странах третьего мира ящур прелсгавляет собой знлемическую болезнь, приносящую огромный зкономический урон и приводящую к человеческим жертвам. Для получения вакцины против этого заболевания был использован клонированный белковый антиген вируса ящура. Другая очень важная задача заключается во введении генов, кодируюцшх ферменты и другие белки азот- фиксации. в геном культурных растений. обычно не способных фиксировать азот.
В этом направлении до практических результатов пока еше далеко, но совершенно очевидно, что достижение этой цели окажет глубокое воздействие на сельское хозяйство во всем мире. 30.22. Осуществлено клаввроввние генов ввтерфероиов Интерфероны — это белки. секретируемые некоторыми клетками позвоночных при заражении их вирусом.
Они связываются с клеточной мембраной незараженных клеток и придают им иммунносгь по отношению к инфекции этим же или каким-либо другим вирусом. Вывод о существовании таких веществ первоначально был сделан на основании медицинских наблюдений, согласно которым больные одним вирусным заболеванием не подвержены в это время другой вирусной инфекции; это навело на мысль, что первая вирусная инфекция препятствует развитию второй.
Когда в 50-х годах был открыт интерферон, появилась надежда, что он окажется полезным при лечении вирусных заболеваний, большая часть которых не поддается лечению с помощью лекарств и антибиотиков. К таким болезням относятся обычная простуда, грипп. полиомиелит, ветряная оспа. герпес, вирусный гепатит и многие другие. В первую очередь рассчитывали на то, что интерферон сможет помочь в лечении некоторых нилов рака у человека, которые„как долгое время предполагалось. вызываются вирусами. Однако на протяжении многих лет интерферон оставался за~едкой, поскольку оказалось, что он синтезируется в зараженных клетках в крайне незначительных количествах и возможность его выделения в количествах, достаточных для определения структуры и изучения биологической активности в течение длительного времени, представлялась маловероятной, С развитием эффективных метолов выделения и идентификации следовых количеств белков и их генов было установлено, что интерфероны — это гликопротеины, состоящие приблизительно из 160 аминокислотных остатков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
