Lenindzher Основы биохимии т.3 (1128697), страница 72
Текст из файла (страница 72)
Поскольку многие рссэриктируюШис знлонуклеазы расщепляют лишь специфические участки ДНК, облалающис осевой симметрией второю парилка, образующиеся липкие концы комплемензарным образом взанмадействугот с концами любой лругой ДНК, разрезанной той же самой зидоиуклеазой. При отжито нз соответствующих фрагмен юв ДНК, и ДНК, но~уз снова образоваться исходные молекулы или же новые рекомбииантные ДНК, как зто показано на рисунке Ковалентное сшивание фрагментов осуществляется под действием ДНК-лигазы.
один участок, узнаваемый данной рестриктазой. Следовательно, нуклеотидные последовательности выступающих концов двух расщепленных ДНК будут комплементарны. Если теперь смешать эти ДНК, нагреть и медленно охладить, то их липкие концы образуют комплементарные пары оснований, в результате чего возникнет новая рекомбинаитная ДНК, цепи которой имеют единичные разрывы (рис. 30-19).
Прн обработке таких ДНК ДНК-лигазой в присутствии источников энергии образуется новая ковалентно сшитая рекомбинантная ДНК. Другой юпочевой фермент, широко применяемый для соединения фрагментов ДНК;это терминальная трансфераза, которая способна присоединять к 3'-концу цепей ДНК большое число следующих друг за другом дезоксирибоиуклеотядных остатков. Этот фермент не- специфичен н может использовать в качестве предшественников бАТР, с)ТТР, гЮТР или ИСТР. Поскольку для действия терминальной трансферазы не нужна матрица, она способна построить 3'-концевые последовательности, состоящие из нуклеотидов одного типа. Следовательно, к 3'-концам одной из двухцепочечной ДНК можно добавить ро1у(О)- хвосты, а к 3'-концам другой-ро1у(С)- хвосты.
Поскольку такие хвосты комплементарны друг другу, с их помощью можно соединить две ДНК за счет образования комплементарных пар между основаниями их липких концов (рис. 30-20); 9в2 ЧАСТЬ РК МЕХАНИЗМЫ ПЕРЕДАЧИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ 3' 5' 3' ДНК, + 3СТР Днк, с тупыми концами + 3стр 3' Ро)у )С) Рекомбинантная ДНК, собранная из двух частсп, поддерживаемых вместе эа счет компэементврыко взаимодействия хвостов рс)у Кл и ро)у )С) ковалентная сшивка соединенных таким образом ДНК осуществляется ДНК-ли- С помощью этих и других ферментов уже соединены многие ДНК из самых разных источников.
Одним из первых достижений в этом направлении бьшо встраивание гена рРНК, выделенного из шпорцевой лягушки Хецорыз )сер)д, в плазмиду Е. со)Е В другом раннем эксперименте ДНК обезьяньего вируса БЧ40 (равд. 27.29) была встроена в ДНК фага )ь т.е. были объединены хромосомы животного и бактериального вирусов.
С тех пор в лабораторных условиях были получены сотни различных искусственных рекомбинантных ДНК. Следующим этапом в развитии техники получения рекомбинантных ДНК была разработка способов введения чужеродных генов в клетку-хозяина. Наиболее распространенными носителями, используемымн для введения чужеродных генов в геном Е. со1), получившими название векторов, стали плазмилы и ДНК фага ) . Плаэмиды (разд.
27.15)-это нхйуольшне кольцевые двухцепочечные ДНК, Рис. 30-Ю. Использование терминальной транс- феразы дзы достраивания концов ДНК с целью обеспечения фрагь1ентов ДНК комплементар- ными липкими концами. присутствуюшие в цнтоплвзме большинства видов бактерий. В каждой плазмиде содержится от Х)00 до 100000 оснований, Маленькие плазьунцы могут присутствовать в клетке в количестве 20 и более копий; плазмид более крупного размера в клетке бывает не более 1-2 копий. Каждая плазмида солержит несколько, а иногда и много генов, которые реплнцируются, транскрибируются и транслируются независимо от хромосомных генов, но одновременно с ними. Плазмилы легко выделить и отделить от бактериальных хромосом, от которых они отличаются по размеру, нуклеотидному составу и плотности, Плазмиды облалают двумя замечательными свойствами, полезными для генетического манипулирования. Во-первых, они могут переноситься от одной клетки к другой и лаже от бактерии одного вида к бактерии другого.
Например, если смешать клетки Бабполе))а гур))йныу)ыпэ с клетками штамма Е. сой, устойчивого к пенициллину, то первые приобретают устойчивость к пенициллину. Это связано с тем, что присутствующий в плазмиде Е. сей ген устойчивости к пенициллину, иазы- ГЛ ЗО. РЕКОМБИНАНИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ 983 ваемый )(-фактором, может передаваться оз клеток Е.
гтяй клеткам 5. турйтт»пылят. Второе свойство плазмид заключается в том, что в них можно достаточно легко встраивать чужеродные гены, которые зазем в качестве «пассажиров» могут переноситься в Е. сай и становиться там частью генома клез.ки-хозяина. Для переноса чужеродного гена в Е сей можно использовать .также ДНК фага Х Если рекомбинантную ДНК фага )., несущую чужеродный ген, смешать с белком оболочки фага )., то образуются инфекционные фаговые частицы, при условии, конечно, чзо рекомбинантная ДНК по своему размеру не сильно отличается от природной ДНК фага. Этот способ ввеления чужеродного гена в Е.
сей лучше прелылушего. поскольку фат 1 чрезвычайно эффективно инфицирует клетку-хозяина, в то время как плазмиды проникают в интактную клетку Е сой лишь изредка. Фаг Х является умеренньлч фатом (разд. 30.9), и его ДНК вместе с чужеродным геном, который она несет, способна встраиваться в хромосому Е со(т'. В этом случае ДНК фаш ). и чужеродный ген будут реплицироваться при каждом цикле клеточного деления.
Рассмотрим теперь более подробно, каким образом гены выделяют, вводят в клетки-хозяева, клонируют и осутттествляют трансляцию с пелью получения тех или иных продуктов. Слово «клон» имеет греческое происхождение и означает побег или черенок, применяемый для размножения рве~ения. Оно используется в двух смыслах, Во-первых, под термином клояировиние клеглок понимают образование группы генетически идентичных клеток, развившихся из одной клетки, как это имев.т место в случае линии иммунопитов, настроенных на синтез определенного типа антител.
Под термином же молекулярное кюяироваяие или клонирование генов имеют в виду образование множества идентичных копий гена, полученных в результате репликации одного гена„введенного в клетку- хозяина. 30.14. Выделение гентзн н получение НДгхК Из фрагментов вирусных и бактериальных хромосом уже выделен целый ряд генов. Что же касается выделения специфических генов нз фрагментированных эукариотических хромосом. то реализация этой процедуры все еще остается довольно сложной и трудоемкой задачей. Существует два основных подхода для получения специфических генов, подлежащих затем рекомбинации и клонированию.
В одном из них, который получил название «шотган» (от англ. я)зозяцп -дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают рестриктирующей зндонуклеазой, образующей в местах разрыва выступающие концы. Полученные фрагменты ДНК встраивают затем в плазмиды Е сой, «раскрытые» (т.е. переведенные в линейную форму) с помощью той же самой рес~риктируюшей эндонуклеазы. В результате образуется чрезвычайно сложная смесь, состоящая, вероятно, из тысяч разных рекомбинантных плазмнд. среди которых лишь одна может содержать нужный ген. Для поиска плазмиды, несущей этот ген, разработаны специальные процедуры, которые называют скринингом.
Олна из таких процедур описана в разд. 30.17. Другой подход, используемый для получения нужных генов, состоит в конструировании на мРНК-матрице комплементарной по отношению к ней ДНК (кДНК). Хотя, как мы уже говорили, большинство клеток содержит трудно- разделимые смеси множества различных мРНК, тем не менее иногда удается выделить чистую мРНК, кодирующую какой-либо один специфический белок. Для этого используют специализированные клетки, которые вырабатывают цреимушественно какой-то один втщ белка. Например.
из ретикулоцитов-незрелых красных кровяных клеток —, в которых гемоглобин составляет 90;:,' синтезируемого белка, можно вьшелить мРНК для пи ()-полипептидных цепей гемоглобина. Аналогичным образом из В-клеток островков Лангерганса поджелудочной 984 ЧАСТЬ (У.
МЕХАНИЗМЪ! ПЕРЕДАЧИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ полисом. Специфическую МРНК, на которой синтезировался белок, можно затем изнлечь из осадка и выделить с помощью хроматографических методов в практически чистом виде, т.е. без примесей других мРНК.
Теперь специфическую МРНК, копирующую белок, ген которо~о надо получить, можно использовать в качестве матрицы для ферментатианого синтеза кДНК с помощью обратной транскриптазы (разд. 208.26). Однако для функционирования обратной транскрип.газы необходима затравочная ДНК. Напомним (разд. 28.22), что на 3'-конце молекул МРНК находитсн ро)у(А)-последовательность. Поэтому к МРНК добавляют ро!у(Т), которая образует с ро!у(А)-хвостом МРНК дву)шепочечные участки (рис. 30-21), служащие затравкой для обратной транскриптазы. В таких условиях обратная транскриптаза сннтези- уималаам.втн )лт) чат «о пл агар Н о у вм рнии реу",П ра Ннв* олпе ее, 'г™ а и литр у,лг лц Олпоеми мм к.,нх о ~~ ц дИК-млпмоаоа ! Штрл перпл пмп, «о .папмрею мамлаче лупием у*со т | раман лаем нпальпм упплпее .
лмеолаемп ях с ап ияуслу. пвхчав и Чюумаве чу емльпоа р ! р пмпллтр -Л.лп Л-Л 5 Л упп почечна» кдии о прппамнеманм» ро)у гх)-лпоенв и тапа к ептспмлмн м мпаор гпн. апн. иьзя железы можно выделить мРНК для проинсулина человека (равд. 25.11). Однако более общий подход к получению мРНК, кодируюшей специфический белок, состоит в следующем. Клетки лизируют. собирают центрифугированием полисомы и обрабатывают их антителами против того белка, ген которого хотят извлечь. В популяции полисом должны присутствовать полисомы, синтезирующие данный белок на его матрице мРНК. В таких полисомах интересуюший нас белок находится на разных стадиях своего синтеза (разд.
29.14).Очевидно, специфические антитела будут взаимодействовать только сполностью (или почти полностью) достроенным белком, который еще прикреплен к полисомам, синтезирующим его на матрице МРНК. Специфический комплекс антител с полисомами будет при этом выпадать в осадок и таким образом отделяться от прочих рнк х ° ун,ш 5' у Рис. 30-2!.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
