Lenindzher Основы биохимии т.3 (1128697), страница 73
Текст из файла (страница 73)
Конструирование двухпепочечнои кДНК на основе мРНК. Вьшелениую мРНК данного гена транскрибируют с помощью обратной транскриптазы с образованием кДНК. Для работы обратной транскриптазы необходима затравочная ДНК, роль которой выполняет ро)у(Т), комплементарна» Зчконцевому рс)у(А)-хвосту мРНК. Полученную цепь кДНК, которую обычно метят с помошью ралиоактинных предшественников аПЧТР, отлеляют и используют одновременно в качестве матрицы и в качестве затравки для синтеза двухцепочечной шпилечной кДНК в присутствии ДНК-полимеразы !.
Затем . шпильку» расщепляют, цепи подравнивают и к полученной лвулцепочечной кДНК с тупымн концами прнсоелнннют ро)у(А)-хвосты(рис. 30-20). Теперь такая кДНК, иссушая ро!у (А), может быль встроена в вектор (рис. 30-22). Для оумаружения слютветствуюшего природного гена во фрагмеитироеаяньж хромосомах применяют ралноактнвиую кДНК. ГЛ. ЗО. РЕКОМБИНАЦИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ 985 рует на матрипе МРНК комплементарную цепь кДНК из смеси ИМАТР, дТТР, йСТР и ИСТР. Затем МРНК удаляют из гибрида мРНК-кДНК и на одноцепочечной кДНК с помощью ДНК-полимеразы 1 лостраинают вторую цепь; в результате образуется двухцепочечная кДНК, содержащая «шпильку».
После расщепления «шпильки» (рис. 30-21) остается синтетическая двухцепочечная кДНК„соответствующая белку, кодируемому интересующим нас геном. Чтобы упростить последующие процедуры, кДНК в ходе реакции с обратной транскриптазой обычно синтезируют из зхР- дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов. В результате мы имеем синтетическую кДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность данного белка. Заметим, однако, что если эту синтетическую кДНК получали с эукариотической мРНК, то она не идентична природному гену этого белка, поскольку не содержит ни интронов, т.е.
вставочных последовательностей, ни стартовых и терминируюшнх сигналож присущих генам большинства эукариотнческих белков. 30.15. Конструирование вектора, несущего геи Полученную описанным выше способом кДНК можно теперь встроить в плазмиду или вирусный вектор. Для включения кДНК в плазмиду ее необходимо снабдить соответствующими хвостами или липкими концами (рис. 30-21). Это лучше всего сделать путем присоединения к противогвложным 3'-концам двух цепей кДНК ряда повторяющихся дезоксирибонуклеотидных остатков одного типа, например остатков А. Их присоединяют с помощью терминальной трансферазы, которая в присутствии с)АТР достраинаез. на обоих концах двухцепочечной кДНК ро!у(А)-хвост, состоящий из 50-100 остатков. После этого кДНК готова к включению в плазмилный нектор (рис.
30-21). Сначала плазмиду переводят в линейную форму, расщепляя ее в одной точке рестриктируюшей эндонуклеаюй с образованием в месте расщепления тупых концов (разд. 27.24). Затем 3'-концы линейной плазмиды снабжают хвостами, комплементарными тем, которыми были достроены молекулы кДНК. Если кДНК бьин достроены ро!у(А)-хвостами, то плазмиду следует достроить 3'-хвостами из ро1у(Т). После этого линейную плазмиду, обладающую хвостами, и кДНК просто смешивают и предоставляют им возможность образовать пары между комплементарными основаниями.
Среди продуктов такой гибридизации будет находиться унеличенная кольцевая плазмнда, содержащая новый ген, который связан с цлазмидой только за счет комплементарного взаимодействия липких концов. Эти концы можно теперь ковалентно соединить с помощью ДНК-лигазы (разд. 28.12), в результате чего образуется ковалентно замкнутая кольцевая плазмида, несущая новый ген (рис.
30-22). 30.16. Встраивание «ивгруженных» плвзмид в хромосому Е сой Теперь рекомбинантные плазмиды смешивают с клетками Е. сой для трансформации. Попасть в клетку и встроиться в хромосому Е. сой улается лишь нескольким плазмидам, однако эффективность проникновения плазмид можно повысить, добавляя ионы Саэ+. Простейший путь для выявления клеток Е, сой, в которые попали новые гены, состоит в следующем. Клетки выращивают на твердой питательной среде, извлекают из каждой клеточной колонии ДНК и затем определяют, какая из колоний содержит ДНК, гибридизующуюся с радиоактинной кДНК, синтезированной на выделенной ранее мРНК. После этого выращивают колонию клегок Е.
со!й содержащих рекомбинантную плазмиду, в ферментерах в больших объемах на свежей питательной среде, увеличивая число рекомбннан.гных плазмид в 10гх и более раз Подобная рекомбинантная ДНК, несущая неродственные гены из двух разных видов организмов, назынается химерной ДНК. В «Илиале» Гомера Химерой называлось мифическое существо с головой льва, телом козы и хвостом змеи. 986 ЧАСТЬ 1Ч МЕХАНИ3МЫ ПЕРЕДАЧИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ Кольцсвая шжзмида! краонаь стрелки указываст место раокчеплеиня Рсстрнктируввцви чндонукленза, пол двйствинм кото!юй образуются туныв концы 5 3' 3' Ланой!жя плачмнла й Т'!'Р Термнивльнав т акс в за Хвост ро(у (Т) 3 Хвост ро(у (А) ~ Отжиг липких концов Хвост р !у (М 3 кДНК с рс1у (А)-хвоотом лвзлподпя,(НК к)(НК ЛНК-лигаза '.' 3НК моннннтииг ЛНК к,.(НК Рис.
30-22 Присослинснис кДНК. солсржа~цсй ро1у (А)-хвосты, к илазмидс, раситсплснной рост. риктируюшсй энконуклеазой и снабжснной ро1у(Т).хвостамн. Для большей наглядности мас. штаб изобрвжсннык на рисунке плазмилы и кДНК нс отРлжасч ня истинных размсров. В дсйствитсльностн плазмила гораздо круонсс, чсм кДНК одного шна. РР',а ф ф (ж Хвост рг11 (Т) Диюувйя плачинда г ро1уП)-хвсотоя 5 увсччччивиий я в ря.ьырс ялвзмншыи п..ктор, со;Вржвжю 1 ги пра!;~ючюа сяш.й для пеИ нога в «лотку ГЛ. 36 РЕКОМЬИНАЦИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ 937 ЗОЛ7. Клонирование кДНК можно использовать дли поиска соответствующих природных генов Клонированная описанным выше способом кДНК ие идентична природному гену данного белка, поскольку она не содержит интронов, которые обычно присутствуют во многих (если не в большинстве) эукариотических генах, кодируюших белки (разд.
27.Ю). Вспомним, что после коллинеарного матричного синтеза мРНК иа таких генах в ходе обычной биологической транскрипции участки мРНК, комплементарные интронам в ДНК, вырезаются до трансляции мРНК на рибосомах (разд. 28.23). Клонироваиную кДНК можно использовать для того, чтобы из генома родительской клетки, содержащей тысячи генов, «вытащить» настоящий природный ген, кодирующий данный белок. С этой целью выделяют ДНК исследуемого организма, расщепляют ее какой-либо рестриктирующей эндонуклеазой и встраивают образовавшиеся многочисленные фрагменты ДНК с помощью описанных выше методов в подходящий вектор-обычно в ДНК фага 7.
Затем рекомбинантные ДНК упаковывают в вирусные частицы, добавляя белок оболочки, н полученными фаговыми частицами, несущими встроенный ген, заражают нормальные клетки Е. сей, Из лизатов этих клеток можно получить много различных вирусных ДНК, которые содержат все (или почти все) гены донорного организма. Из этой «библиотеки генов» природный ген, кодирующий интересуюший иас белок, можно выделить простым и специфическим способом: к «библиотеке» добавляют "Р-кДНК, соответствующую этому белку, смесь нагревают и затем дают ей остыть.
При этом между цепями кДНК и природного гена формируются гибрилные дуплексы. Хотя в природном гене содержится определенное число интронов, не имеющих комплементариых партнеров в кДНК, его экзоны узнают цепи кДНК и гибридизуются с ними. Образующиеся радиоактивные гибриды можно выделить, извлечь из них интере- сующий иас природный ген и клонировать его в плаэмиде или в фаге Х по описанной выше схеме. Поскольку в настоящее время нуклеотидную последовательность в ДНК можно определить быстро и точно (разд.
27.29)„по установленной последовательности кДНК выводят амииокислотную последовательность кодируемого ею белка, а также нуклеотидную последовательность мРНК, соответствующей этому белку. И хотя кДНК не содержит информации о полной нуклеотидной последовательности природного гена, соответствующего эукариотическому белку, тем не менее при помощи меченой кДНК, полученной с мРНК данного белка, природный ген можно вьщелять и клонировать. ЗОЛО. Экспрессия клонированных генов усилнваетсн с помощью промотора Для транскрипции многих генов и последующей трансляции их мРНК с образованием соответствующих белков необходимо участие промотора и оператора, которые указывают место, в котором РНК-полимераза связывается и начинает транскрипцию (разд.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
