Терней - Органическая химия II (1125893), страница 70
Текст из файла (страница 70)
25-5. Определение структуры глутатиопа посредством гидролиза. Поскольку цистеин находится в обоих дипептидных фрагментах, он должен стоять г центре глутатиона. Из двух возможных оставшихся структур А и Б предпочтение следует отдать первой, так как С-концевой аминокислотой дипептндного фрагмента, состоящего иа глицнна и цнстенна, является глпцин. Участие у-карбоксильной группы боковой цепи глутаминовой кислоты в обраеовайин пептидной связи — необычное явление. Глутатион — это не продукт распада белков, а биологически вая;пый трвпептнд. зве Для полного воссоздания первичнои структуры полипептида необходимо идентифицировать аминокислоты, которые входят в состав каждого из фрагментов, получепных в результате неполного гидролиза, и решить, в какой последовательности зти аминокислоты соединяются друг с другом в исходном полипептиде.
Один из подходов к решению атой проблемы состоит в том, что проводят полный гидролиз фрагментов, идентифицируют составляю1цие их аминокислоты, а затем осуществляют химический синтез фрагментов. Другой путь — избирательнь1й гидролиз, при котором от фрагмента отщепляют по одной аминокислоте на каждом зтапе, чаще всего при помощи ферментов из поджелудочной железы, так называемых карбоксипептидаз. Эти ферменты способны гидролизовать только С-концевые аминокислоты и, следовательно, постепенно разрушать пептидный фрагмент с С-конца. Нередко достаточно бывает проанализировать различные концентрации аминокислот полученных под действием карбоксипептидазы, которая гидролизовала фрагмент в течение постепенно возрастающих промежутков времени, чтобы получить необходимые данные относительно аминокислотной последовательности. Огромный п1аг вперед в химическом анализе полипептидов был сделан з 1950 г., когда П.
Здман установил, что Х-концевую аминокислоту можно удалить при помощи фенилизотиоцианата. В результате следующая за пей 404 аминокислота становится И-концевой, и ее в свою очередь можно отщепить действием фенилизотиоцианата и т. д. Деградация по Эдману изображена на рис. 25-6. О !! СеНь — Х=С=Б + Н ХСН вЂ” С вЂ” ХН вЂ” пеипий ! СН ОН СеНь ХН С ХН СН СНгОН !! .С=О ХЙ вЂ” неипий си со н н Сеиь ХН С Х Н С сн Он НО О+ ХН вЂ” иеипий СеНь — ХН вЂ” С СНСНгОН 0 СеНь ХН (.=Х з снсн он С НО ХН- пеиппй 0 11,Х вЂ” иеиппй + н / СНСНгОН я=с, О СеНь юиогиданпюин Рис.
25-6. Деградация по Эдмаиу. в результате реакции фенилизотиоцианата с х-концевой аминокислотой образуется аддукт(тиомочевина), который циклизуется в уксусной кислоте. При кислотном гидролизе аддукт расщепляется, давая новую Х-когп(евую аминокислоту (Н,Х вЂ” пептид) и неустойчивое промежуточное соединение, которое изомеризуется в тиогидантоин. специфический тиогидантоин служит для идентификации первой хконцевой аминокислоты.
Проводя во второй раз всю последовательность реакций, моягно определить следующую аминокислоту, так как она стала Х-концевой в результате деградации по Здману. Химическое определение первичной структуры даже простого полипептида, каким бы методом оно не проводилось, требует огромной затраты времени и сил. Б 1958 г.
Сзнгер был удостоен Нобелевской премии по химии за расшифровку первичной структуры инсулина — полипептида, состоящего «всего лишь» из 51 аминокислоты (рис. 25-4). КЛАССИ'1ЕС11ИИ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ. Мы уже познакомились со всеми реакциями, которые требуются для синтеза пептида. 13едь реакции, которые применяются для превращения карбоксильной группы аминокислоты в соответствующую амидпую группу, могут быть с таким же успехом использованы для синтеза пептидов. Примером классического подхода к синтезу пептидов может служить получение 1,1у-а1а, показанное на рис.
25-7. Как видно пз этой схемы, прежде всего защищают глицип — Х-концеву(о аминокислоту — реакцией с карбобензоксихлоридом. После блокирования аминогруппы активиру(от карбоксильную группу глицина при помощи реакции с этилхлорформиатом. Эта активированная группа взаимодействует затем с зтиловым эфиром алапина, давая первое промежуточное И. При гидролизе пептида образуются следующие дипептиды: д1ц-Ыз, азр-п1п, рЬе-ча1 и ча1-азр.
11акова структура пептида? АминОкислОты, пептидь! и Белки 405 соединение со связью между глицином и аланином. (Реакцию проводят не с самим аланином, а его эфиром, с тем чтобы свести до минимума побочные О !! а) разб. ОНБ/б' Сзнаснао — С вЂ” С1+ 11зХСНзсоа11 — + б) разб.
НС1 бензоксикарбонилхлорид глицип Сз1?,СН,ОС(0) МНСН,СОан+ С1 — С(0) — ОЕ$ Х-защищенный глицин 0 1! Сзнзснао — С вЂ” ХНСНасозн Х-защищенный глицин Сзнзснаос(0)11 Нснзс(О)ОС(0) ОЕФ Х-защищенный глицин с активированной карбоксильной группой -Н М вЂ” СН СН С 0 ОЕВ Сз11зсНаос(0)М11СНас(0)ОС(0)ОЕФ-1 а ( а) ( ) этиловый эфир аланина -Соа рааб. Нзо')) Н20 -ЕВОН +=, СзнасНаос(0)ХНСНас(0)11Н вЂ” СН(снз)с(0)ОЕ$ + —— 011'3 — 'а' Сан,С11аос(0) И Нснас(0) МНСН(снз)соан На/рб — С,Н,СН, + СО,+ На) )СНаС(О) МНСН(СНа)СО,Н глицилаланин (а1у.а1а) Рис.
25-7. классический синтез глицилаланина. реакции, в которых участвует свободная карбоксильная группа.) После образования связи между глицином и аланином подвергают гидролизу эфирную связь, чтобы освободить карбоксильную группу С-концевой аминокислоты. На последней стадии синтеза снимают защитную группу с глицина каталитическим гидрогенолизом. 14. Как бы вы стали проводить классический синтез а1а-р1у и и1у-а1а-д1у? Вышеприведенная схема допускает некоторые изменения: например, вместо этилхлорформиата для активации можно применять дициклогексилкарбодиимид. Однако, каковы бы ни были эти изменения, синтез дипептида требует нескольких стадий. А для синтеза пептида из 50 аминокислотных остатков понадобится огромное число стадий, что и служит основным ограничением классического подхода к получению пептидов.
Ка)кдая стадия реакции, подобной приведенной на рис. 25-7, дает продукт, который необходимо выделить и желательно очистить прежде, чем приступить к следующей стадии синтеза. Опыт работы в лаборатории органической химии подготовил вас, наверно, к тому, что при очистке и выделении органических соединений приходится нередко сталкиваться со значительными трудностями. Почти никогда не удается получить продукт с выходом более 90 или 95;4.
Последовательность многих реакций, каждая из которых дает продукт с выходом 90%, приведет к очень небольшому общему выходу. 11апример„синтез из ста стадий, каждая из которых протекает с 90%-ным выходом, позволит получить общий выход, равный 0,901зз х 100% или 0,003%! Таким образом, синтез даже пе очень крупного пептида может потребовать огромное количество исходного вещества для того, чтобы продукт не только можно было разглядеть невооруженным глазом, но и провести с ним дальнейшую работу. Р1и)ке описан метод, который позволяет избежать огромных потерь, связанных с непрерывными выделением и очисткой промежуточных продуктов при синтезе пептидов.
Этот метод находит очень п1ирокое применение в биохимии. Аминокислоты, пвптиды и вилки 407 ных полимерных носителей для твердофазного синтеза пептидов. Шире всего в этих целях используется полистирол. Однако около 1% фенильных групп связано с группами — СН,С1. Ниже показан фрагмент такого полимера. ~ — СН вЂ” СНх — СН вЂ” СНх — СН вЂ” СН,— СН вЂ” СНх — СН вЂ” СНх — 1 сн с1 СНхС1 Большое значение в этом методе имеют размеры зерен полимера и число пор в них. Диаметр зерен может варьировать от 20 до 70 мкм.
25.9. СТРУКТУРА БЕЛКОВ Анализ структуры белка не сводится к установлению его аминокислотной последовательности (первичной структуры). Белок обладает сложной «макро- структурой», которая контролируется более разнообразными и многочислен- Рис. 25-8. Лево- (А) и правовращающие (Б) спирали. Каждая спираль является хиральной. Почти для всех белков характерна правовращающая спираль. Вертикальная линия в центре каждой спирали соответствует «оси спиралив (реально в спиральных колекулях не существует).
ными взаимодействиями, чем пептидные связи, составляющие его первичную структуру. Присутствие в молекуле белка участков, отличающихся характерной формой, свидетельствует о существовании промежуточного уровня структурной организации. «Макроструктура» белка получила название третичной структуры, а промежуточный уровень его организации обозначается термином вторичная. структура. 408 глАвА зб ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКОВ.
Водородные связи играют основную роль в определении конформации полипептидной цепи. Спираль— наиболее высокоорганизованный тип конформации отдельной полипептидной цепит~ ь-аминокислот. Она определяется пространственным расположением следующих атомов а-аминокислот, составляющих цепь: 1) атома углерода карбонильной группы, 2) а-углеродного атома и 3) атома азота а-аминогруппы. Наиболее устойчивой из различных типов спирали является Рис. 25-9. Правовращающая а-спираль в полипептидиой цепи (Во~у Р., ш еТЬе Огдашс Сйеш1еФгу о1 ЬИе», М. Са1ч~п, %.
А. Ргуог, еде,, %. Н. Ргеегпап, 1973). Водородные связи обозначены светлым пунвтиром. Основная спиральная структура углеродного скелета показана жирной штриховой линией.Г правовращающая я-спираль, которая была впервые предложена Полингом и Кори в $950 г. н а основании теоретических соображений. Водородные связи в а-спирали образуются между атомом кислорода карбонильной группы и атомом водорода амидной группы, разделенными тремя аминокислотными остатками. Ось спирали почти параллельна этим водородным связям. На рис. 25-8 изображены идеализированные право- и левовращающие спирали, а а-спираль полипептида показана на рис. 25-9.
Поскольку а-спираль построена только из одного вида повторяющихся О Н 1! ! звеньев ( — С вЂ” С вЂ” И вЂ” ), ее размеры довольно постоянны. Линейное расстоя- (з) ! а ние вдоль оси спирали между двумя однородными атомами (шаг спирали) составляет 1,5 А. Угол между перпендикуляром к оси спирали и плоскостью, занимаемой данным аминокислотным остатком, равен 26'. Один виток спирали включает 3,6 аминокислотных остатка.
Зто соответствует линейному расстоянию вдоль оси спирали, равному 5,4 Л. Если бы а-спираль была единственным типом вторичной структуры белков, то все они были бы жесткими палочковидными образованиями. Поскольку это не так, следует заключить, что а-спирали составляют лишь отдельные участки полипептидных цепей. Отклонение от а-спиральной структуры вызвано разнообразными факторами; к ним относится содержание пролина, оксипролина и (или) валина в пептидной цепи. Послеобразования пептидной связи амидный водород отсутствует в пролине и оксипролине, и эти аминокислотные остатки не могут участвовать в образовании водородных связей в а-спирали. Изопропильная группа валина, по-видимому, ослабляет а-спираль из-за стерического отталкивания.
Другим типом организации полипептидной цепи является так называемая скаадчатпая ~-структура. Она стабилизируется водородными связями между Аминокислоты, пептнды и вилки 409 развернутыми соседними полипептидными цепями, причем цепи могут идти либо в одном и том же направлении («параллельная складчатая р-структура»),. либо в противоположных («антипараллельная складчатая р-структура»), как это показано на рис. 25-10. Рис. 25-10. Складчатая р-структура белков (Магиг А., 11аггош В., ТехьЬоо1с о1 ВюсЬепиа~- гу, 10$Ь ед., Ч~. В.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
