Э. Дероум - Современные методы ЯМР для химических исследований (1125882), страница 66
Текст из файла (страница 66)
Однако мы не будем проводить детального анализа н ограничимся лишь постановкон задачи. Теперь нам предстоит решить, какую величину использовать в качестве оценки ширины линни при определении того, какое расстояние между линиями соответствует порп~ у кнеприемлемого» ослабления. Эта оценка не часто будет соответствовать ширине линни, посколько мы довольно редко можем позволить себе роскошь столь подробно оцифровать спектр. Скорее всего это будет соответствовать той птирнне нашего сигнала, которую он приобретет для использованного нами времени выборки данных прн условии правильной аподизации. Хороший критерий, определяющий, будут лн линии лореицевой формы иметь искажения за счет обрезания сигнала во временнбй области, заключается в том, что времена регистрации должны быть по крайней мере 3 Тг. Если он не соблюдается, то мы должны иметь в виду, что взвешивающая функция несколько ушнряет линии 1т.
е. сокращает кажущееся Т~) до тех пор, пока критерий не выполннтся, Другими словами, для времени выборки в любом измерении, равном А„мы можем принять эффективную ширину линии равной 3!яАп т.е. близкой к величине 1/А,. Если мы хотим увидеть минимально возможное расщепление противофазных компонент, составляющее величину т1» Гц, то в соответствии с этим критерием мы должны иметь время выборки данных порядка 1/2,5Ьу с (мы требуем, чтобы эффективная ширина не превышала 2,5Ьу).
Это условие учитывает степень ипрнемлемого» ослабления, поэтому является менее жестким, чем условие Бакса [5], который предложил использовать время выборки данных, равное 1/1 с, для того, чтобы с гарантией регистрировать линии, разделенные интервалом ./ Гц. Остается неизвестной величина расщепления противофазных пар линий.
В общем случае эту величину совершенно невозможно предсказать, потому что, даже если есс константы имеют большие значения, соответствующие разностные значения могут оказаться малымн. Взаимное уничтожение небольшого числа пар линий в мультнплете может оказаться не существенным, если наличие корредяции можно установить по оставшимся линиям. Поэтому нам следует оценить то минимальное расщепление, которое окажется кзначнмым» 1зто предположение часто не выполняется для сложных мультиплетов с близко расположенными линиями). В качестве наименьшей значимой константы можно взять произвольную величину; для протонных спектров реалистичная оценка этой величины лежит в области 3 Гц. С помощью СОКУ прн соот- 808 Глава 8 302 двумерная корреллционнап спектроскопии яМ Р ветствующем подборе параметров можно регистрировать значительно меньшие по величине константы, но здесь я имею в виду рутинное приложение метода.
Подставляя это число в выведенную выше формулу для времени выборки данных, мы получим минимальное значение А,, примерно 130 мс. Для обычных протонов значеыия Т, и Т3 составляют около 1,5 н 0,3 с (линия шириной 1 Гц типична для молекул среднего размера). Затем мы можем выбрать А, порядка 300 мс и частоту повторения — одно прохождеыие каждые 2 с. Этн выкладки предназначены только для того, чтобы проиллюстрировать ход мысли при задаыин параметров эксперимента. Легко представить мотивы, на основании которых следует уменьшать или увеличивать параметры. Например, форма линии редко бывает лоренцева, потому что даже для фазочувствнтельных спектров вероятно использование в каком-либо виде гауссова окна. Это сделает возможным дальнейшее понижение А, без заметной потери интенсивности.
Во всяком случае, при решении практических задач наши оценки «приемлемого» ослабления и минимально возможного расщепления могут быть переосмыслены. Для образцов, дающих интенсивный спектр, может быть вполне приемлемым ослабление более чем в 2 раза. Важно заранее представить себе то, что мы хотим зарегистрировать, и попытаться оценить необходимое цифровое разрешение. На практике обычно хотят побыстрее записать возможный спектр в качестве стартовой точки исследования. Более тонкие эксперименты, возможно, на более узких полосах частот, можно провести позднее, учитывая результаты, полученные в первом эксперименте.
При этом следует сделать одно предостережение. Многие практические аспекты двумерной спектроскопии ЯМР разрабатывалнсь исследовательскими группамн, изучающими белки. Для таких молекул общий спектр является чрезвычайно сложным, однако он построен из хорошо определенных субъедиыиц; спектров аминокислот. Спектры аминокислот содержат не так много тынов мультиплетов, как правило, с довольно большимн расщеплениями линий и короткими временамн релаксации Тд (когда онн встроены в молекулу белка). Для этих случаев подходят очень небольшие значения А,, В спектрах обычных органических молекул расщепления и ширины линий изменяются в более широких пределах, поэтому простое использование рецептов задания параметров в последовательности СОэт', полученных в экспериментах с белками, вряд ли даст хороший результат. Прн планировании эксперимента здесь нужно учесть данные одномерного спектра.
Сколько это займет времеыи? Сейчас мы (наконец-то!) подошли к вопросу о том, сколько времени может потребоваться для регистрации типичного спектра СОВУ. Рассмотрим опять изучеыиый ранее случай спектра шириной 10 м. д. при 500 МГц (будем, однако, иметь в виду, что необходимость записывать весь диапазон 10 м. д. возникает не часто). В соответствии с критерием Найквиста нам нужно для инкремента по Е иметь значение 0,2 мс (с квадратурным детектированием), поэтому, чтобы получить время регистрации 130 мс по этой координате, мы должны сделать 650 шагов. Если использовать 6 прохождений на каждый шаг (2 холостых плюс 4 реальных) и частоту повторения 2 с на прохождеыие, то эксперимент займет около 2 ч (существенное улучшение по сравнению с 17 днями1).
Даыный случай можно рассматривать как самый неблагополучный, поскольку здесь используется широкий спектральный диапазон и высокая частота спектрометра. Обычно результаты могут быть получены значительно быстрее. Например, возьмем спектральный диапазон 5 м. д. (на практике это довольно часто оказывается приемлемым, особенно если исключить некоторые отдельно стоящие .сигналы, как обсуждается в разд.
8.3.4), и пусть частота спектрометра будет равна 200 МГц. Нам потребуется 130 шагов длительностью 1 мс, а эксперимент займет примерно 25 мнн. Прн изучеыии образцов, дающих интенсивные лныин спектра, и при переходе к гауссовой форме лиыии эту величину, несомненно, можно сократить на 50'А нлн более (т.е. 64 инкремента по 1,, время эксперимента 10 мнн) без потери информации. Сколько вы успеете за это время поставить и накопить гомоядерных экспериментов двойного резонанса? По мере того как возрастает сложность задачи, эксперимент СО»'г' начинает очень быстро превосходить своего одномерного конкурента.
Из обсуждения этого вопроса следует, что разумно уменьшить число прохождений для каждого ннкремента 1, до абсолютного минимума. Есть два обстоятельства, когда это становится невозможным. На некоторых спектрометрах попытки использовать процедуру С'г'СЕОРЗ при циклнровании фазы могут вызывать появление дополнительных артефактов; на это следует обратить внимание инженера по обслуживанию приборов. Важно, что реальная чувствительность эксперимента может оказаться слишком ыизкой и потребуется дополнительное накопление. На первый взгляд может показаться, что для сильных сигналов будет достаточно ограничиться только четырьмя прохождениями на инкремент, ыо в действительности это не так.
Мы не должны забывать, что все сигналы ССИ по Е имеют вклады в окончательный преобразованный спектр. Первый нз описанных выше экспериментов содержит в общей сложности 2600 прохождений. Это не совсем эквивалентно регистрации одномерного спектра с таким же числом прохождеыий нз-за того, что, как упоминалось выше, для более поздних шагов по 1, сигнал будет меньше, а также нз-за того, что весь сигнал распределен в двумерном спектре по большему числу пиков, но тем не менее чувствительность довольно высока. Для протонного эксперимента на современном спектрометре с большой рабочей частотой обычно достаточно нескольких миллиграммов вещества средней молекулярной массы для того, чтобы пользоваться минимальным числом прохождений. Если вы будете улучшать разрешение или попытаетесь регистрировать малые константы, то чувствительность быстро упадет, поскольку нужно будет накопить много спектров, да еще к тому же для больших значений Е.
Это пример главе 8 308 Двумерная корреляционная спектроскопяя ЯМР извечного н характерного для всех форм спектроскопии баланса чувствительности н разрешения. Теперь мы можем также получить представление о том, какого тына проблемы возникают прн проведении эксперимента СОБУ. Для спектра с диапазоном 5 м. д. на 200 МГц потребуется провести регистрацию 300 точек для получения по координате !з времени выборки данных 300 мс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
