К.И. Грандберг - Органическая химия (1125789), страница 64
Текст из файла (страница 64)
д. !! О Затем наращивают пептидную цепь, пропуская через смолу растворы соответствующих реагентов. Для этого сначала убирают группу, защищающую конечную ХНг-группу (2-я стадия). Пропуская через смолу раствор другой аминокислоты' . с защищенной аминогруппой в присутствии водоотнимающих реагентов, образуют пептидную связь между первой и второй . аминокислотой (3-я стадия). Если затем убрать защитнукг ' группу (4-я стадия), синтез пептида можно вести далее. После наращивания пептидной цепи до нужной величины гидролизуют «якорную» сложноэфирную связь и смывают полипептид со смолы: Смола — СН О вЂ” СΠ— СНК вЂ” МН ... СΠ— СНК'МН вЂ” — » г г сн,ооон — » Смола — СНгОН + НООССНКМН ... СОСНК'МН полил«птид Метод Мерифильда прост в техническом оформлении, что .
позволяет полностью автоматизировать процесс. Поэтому, хотя ' вышеупомянутые белки инсулин (51 аминокислота) и рибо; нуклеаза (124 аминокислоты) были синтезированы классиче; скими методами, метод Мерифильда позволяет значительно сократить затраты труда и времени на синтез белков. Так, ри-, ' бонуклеаза была синтезирована Мерифильдом в 1968 г. менее ' чем за месяц, хотя синтез включал 369 последовательных,, реакций. 506 9. Строение белковых молекул Особый характер белка каждого вида связан не только с длиной, составом и строением входящих в его молекулу полипептидных цепей, но также и с тем способом, которым эти полипептидные цепи ориентируются в специфические, зачастую метастабильные конформации с различной степенью гидратации.
В связи с этой метастабильностью хорошо известны изменения, быстро и необрагимо происходящие при нагревании яичного белка. Они служат наглядным примером реакций, происходящих при денатурации. Значительное внимание уделялось исследованию возможных способов расположения пептидных цепей, приводящих к устойчивым конформациям. В 1952 г. Л. Полинг показал, что наиболее выгодным расположением, которое осуществляется во многих пептидах и белках, является а-спираль.
Пептидные цепи а-спирали свернуты таким образом, что возможно образование водородных связей между амидными водородными атомами и карбонильными группами, разделенными тремя-четырьмя аминокислотными фрагментами (рис. 84). Водородные связи почти параллельны основной оси спирали, а расстояние между витками составляет около 0,55 нм.
На один виток а-спирали приходится около 3,6 остатка аминокислот. Боковые цепи аминокислот лежат на внешней стороне а-спирали. Однако пространственные затруднения, возникаю- о щие между боковыми группами некоторых аминокислот, могут существенно де- н формировать нормальную а-спираль и . о о . м вызвать изгиб цепи. Наиболее существенно в этом отношении влияние пролина и -'' ° оксипролина. Х ! о Вторичную структуру а-спирали име- ! ют, например, миозин и а-кератин. Ряд д белков (фиброин, !)-кератин), состоящих в основном из небольших молекул амино- н кислот, образуют другую компактную вторичную структуру, называемую «сложенный лист».
В структуре любого белка имеется, та- ким образом, несколько степеней усложне- Рло 84. а-Сззраль ния. Первичная структура белка пред- белковой молекулы 507 ставляет собой специфическую последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Вторичная структура определяется способом, которым скручена цепь; в частности, последняя может образовывать а-спираль. Наконец, третичная структура— это способ, которым свернутая в спираль цепь (цепи) изогнута и гидратирована в природном (нативном) белке.
Для молекул белков, состоящих из нескольких полипептидных цепей, рассматривают и так называемые четвертична«е структуры, определяющие тип взаимодействия между отдельными цепями. На рис. 86 схематично изобра- жена структура цепи Р-гемогло- О бина. Черные точки изображают отдельные аминокислоты (их 146), связанные в цепь. Последовательгго ность этих аминокислот образует первичную структуру этого фрагмента белковой молекулы. Конформация цепи в трехмерном пространстве, изображенная фигумо рой, похожей на свернутую змею, Ри . л5. Простр стневная отражает третичную структуру структура цепи б-гемоглобина цепи. Внутри обведенной фигуры цепь аминокислот имеет форму а-спирали, что определяет вторичную структуру фрагмента !3-гемоглобина.
Квадрат со штриховкой обозначает гем с атомом железа. Молекула самого гемоглобина, находящегося в красных кровяных тельцах, состоит из четырех цепей: двух !)-гемоглобина и двух а-гемоглобина. Совокупность этих четырех цепей определяет четвертичную структуру гемоглобина. Первичная структура белков устанавливается методами химической деструкции, в основном методом ступенчатого гидролиза илн ферментативной деструкции с помощью различных «протеаз». Используя набор различных «протеаз», селективно гидролизующих связи между конкретными аминокислотами, изменяя условия ферментативного и химического гидролиза (время, температуру и рН), можно получать различные осколки, на основании которых создается представление об исходной белковой молекуле.
Очень важную роль в определении первичной структуры белков сыграли методы определе- . ния концевых групп. С-Концевые аминокислоты (аминокислоты со свободной ' СООН-группой) определяют, используя фермент карбоксипеп- 508 тидазу, которая селективно отщепляет эту аминокислоту от молекулы полипептида или белка. После ее идентификации операцию повторяют до определения всей последовательности аминокислот. Метод Эдмана, разработанный для Х-концевых аминокис- лот (аминокислот со свободной )чНз-группой), основан на реак- ции полипептидов или белков с фенилизотиоцианатом, образующим фенилтиомочевину по концевой ХН -группе. При последующем гидролизе отщепляется фенилгидантоин, а остальная молекула не затрагивается: РР— М ~ О+В М-СНОС вЂ” СΠ— МН СООН Я !! но Ргмн — с — мнсн(н) со — мн соон Я !! РР— М~ МН Н М СООН С / фЕНИЛРНДННРОИН После идентификации аминокислоты в фенилгидантоине (лучше всего с помощью ГЖХ) операцию повторяют до определения всей последовательности аминокислот.
Ранее для определения )м(-концевой аминокислоты широко использовали 2,4-динитрофторбензол. Незащищенные аминогруппы на концах цепей дают 2,4-динитрофенильные производные, по которым после кислотного гидролиза белка легко установить, какие именно аминокислоты были концевыми. Последовательность аминокислот в коротких линейных пептидах (и особенно в циклопептидах) успешно определяют с помощью масс-спектрометрии. В настоящее время первичная структура установлена приблизительно для 1300 белков, отдельные из которых содержат более 400 аминокислот (трансаминаза — 410 аминокислот), а получено синтетически более 60 белков.
Разработка автоматических анализаторов аминокислот с применением ионообменников и элюированием буферными растворами с возрастающими значениями рН позволяет в настоящее время работать с приборами, производящими за несколько часов полный количественный анализ любого белка (для навески в 5 мг) с точностью до 1%. 509 ! — з-з — ! (МН '(Тли.(оий-вал-глу-глу-цие-цис.лла-сар-вал-цие.сар.лей-тир.глу.яей-глу-ле»-тир-цис-лев(ОООН( ! в э ! кн,нн, з з ! ! ! ! (НН (Феи-вал-лли-глу.Г»е-лей-цие.Тли.сер.гие.лей.вал-глу-йла-пей-тир.Лей-вал-цие-гл» ! (НООС)А»а-Лиа-Пра-тре-Тир-Феи-Феи-Гли-Арг-Глу Рис. 86. Последовательность аминокислот в молекуле бычьего инсулина Найденная последовательность 51 аминокислоты в бычьем, инсулине изображена на рис.
88. Дисульфидные связи удер-. живают две пецтидные цепи в изогнутом состоянии и играют важную роль в определении конформации и физиологических свойств инсулина. Последовательность аминокислот в пептидных цепях белков, например инсулина, производит впечатление случайного и лишенного систематичности набора; однако она может ока- ' зывать влияние на свойства белков несколькими способами. Так, кислотно-основные свойства белков и их изоэлектриче-- ские точки определяются числом и расположением кислых и ( основных аминокислот. Пространственное влияние замещающих групп определяет стабильность и точки изгиба пептидныхспиралей. Последовательность аминокислот также может оказывать влияние на степень межмолекулярных взаимодействий и растворимость белков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
