А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 154
Текст из файла (страница 154)
Тема 2. Приготовление питательных сред и метолы стерилизации (занятие 4). Тема 3. Получение накопительных и чистых культур микроорганизмов (занятия 5 — 6). Тема 4. Идентификация микроорганизмов (занятия 7 — 11). у~ма з. Методы количественного учета микроорганизмов (занятие 12). Студенты, выполняющие практические работы по предлагаемой программе, знакомятся с основами микробиологии на так называемом »малом» практикуме, который обязателен для всех специальностей студентов-биологов любых высших учебных заве- лений. Программа рассчитана на 11 практических занятий (по 3 академических часа каждое) и 3 сел1инарских занятия (по 2 академических часа каждое), т.е. на период одного семестра. На некоторых занятиях студенты изучают две темы.
На практических занятиях студенты овладевают техникой микробиологической работы в лаборатории и готовят теоретические разделы программы для участия в семинарских занятиях. На семинарах студентам целесообразно предлагать выступить с докладами на означенные темы или на другие темы по выбору преподавателя.
ТЕМА 1. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ (ЗАНЯТИЯ 1 — 3) Занятие 1 еРР .Р аР— 3! "" Р» Юп" ' РР " Р низмов. Для этого студентам необхолимо изучить устройство микроскопа, ознакомиться с особенностями разных видов микроскопии (светлопольной, темнопольной, фазово-контрастной, люминесцентной) и научиться готовить препараты микроорганизмов. 520 1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ЖИВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И ЗНАКОМСТВО С ИХ МОРФОЛОГИЕЙ ВВЕДЕНИЕ. ПРАВИЛА РАБОТЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ Препараты готовят на обезжиренных предметных стеклах. Живые микроорганизмы рассматривают в препаратах «раздавленная капля», «висячая капля» и «отпечаток».
Для приготовления препарата «раздавленная капля» на предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и помещают в нее с помощью простерилизованной в пламени горелки бактериологической петли небольшое количество культуры изучаемого микроорганизма, выросшей на твердой питательной среле, размешивают и накрывают покровным стеклом. Каплю культуры, выращенной в жидкой питательной среде, наносят на предметное стекло стерильной пипеткой.
Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы после прижимания ее покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под него. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой, которую затем опускают в дезинфицирующий раствор. Препараты живых клеток рассматривают с «сухими системами» микроскопа (8 х и 4() х), Зидаиие. Приготовить препараты «раздавленная капля» микроорганизмов с различной морфологией: кокки (М!сгососсиз !и!сиз); стрептококки (Теисопозгос тезепгегоМез); пбшочковидные бактерии (1,асгоЬас!1!из с!е!Ьбиес!с!б); извитые формы (лйоб(ояр(Н1!ит биЬгит); нитчатые формы (ОзсбНа1опа зр., Яр!би!1па зр., АпаЬаепа»апаЬЛХ, РгзсЬеге!1а тиас!со!а). Просмотреть и зарисовать мбгкроор!анизмы, отметить форму и сочетание клеток. При»бсчалйе.
Вместо указанных видов могут быть использованы другие организмы с соответствующей морфологией. Часть микроорганизмов может быть продемонстрирована в виде готовых препаратов. б д « .бб — бб,бб — бб,бб — бб. Занятие 2 2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ФИКСИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ И ЗНАКОМСТВО С ИХ МОРФОЛОГИЕЙ На обезжиренное предметное стекло помещают каплю водопроводной воды и вносят в нее бактериологической петлей культуру с твердой среды. Каплю жидкой культуры наносят на предметное стекло пипеткой. Равномерно размазывают петлей каплю с микроорганизмами тонким слоем, высушивают на воздухе и фиксируют. хббб«»ббббби: уб Р б: б " у б» стеклу; сделать микроорганизмы более восприимчивыми к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше живых. Самым распространенным способом фиксации микроорганизмов является термическая обработка.
Для этого высушенный препарат обычно трижлы проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. При исследовании строения микроорганизмов часто прибегают к фиксации клеток различными химическими вещесггбаьби (спирт, осмиевая кислота, формалин и др.). Фиксирующую жидкость наливают на высушенный препарат, либо препарат на определенное время (3 — 15 мин) погружают в стакан с фиксатором.
Для окраски фиксированных микроорганизмов чаще всего используют анилиновые красители. Существуют простые и дифференциальные способы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка так, что становится хо- 521 рошо видна ее форма и размеры. Дифференциальная окраска предполагает окрашивание не всей клетки, а только определенных ее структур или включений. Для окрашивания клеток фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки, лежащие над кюветой, и заливают красителем на 1 — 15 мин.
Следят за тем, чтобы во врелгя окрашнвания раствор красителя на мазке не подсыхал. В случае необходимости на мазок наливают новые порции красителя. По окончании окраски препарат промывакгг водой, высушиюют, помещают на окрашенный мазок каплю иммерсионного масла и просматривают с объективами 90к или 100к. Задание. Приготовить гЬиксярованпые препараты и окрасить гЬуксином клетки следующих микроорганизмов: палочковилные бактерии — Рзеидогпопаз зрл изогнутые и ветвящиеся бактерии — МусоЬасгепятфаьезсепз, йисаггйа зрл мицелиальные формы„образующие экзоспоры — Лггерготусез зрл бактерии, образующие выросты — Сап(оЬасгег сгезсепшз (стебельки), и простеки — ййоИоппсгоЬУигп гдпп!еЬь' Просмотреть и зарисовать микроорганизмы, отметить форму и сочетание клеток.
д ': .. ~~-8~. Занятие 3 3. ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ МЕТОДОМ НЕГАТИВНОГО КОНТРАСТИРОВАНИЯ Небольшое количество клеток АеогоЬасгег с/поососсип~ с твердой питательной среды помещают петлей на предметное стекло в каплю водопроволной волы, смешивают с каплей туши, накрывают покровным стеклом и просматривают с объективом 40к. На сером фоне препарата хорошо видны бесцветные капсулы, окружающие клетки.
4. ОКРАСКА ЭНДОСПОР Небольшое количество клеток 1)ас(1/из сегеиз или другого вила спорообразуюших бактерий с твердой среды помещают петлей на предметное стекло в каплю водопроводной воды и делают мазок. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки и заливают раствором метиленового синего по Леффлеру. Краситель доводят до кипения, держа предметное стекло пинцетом над пламенем горелки. По мере испарения красителя добавляют новые его порции.
Продолжительность окраски трехкратная, по 10 — 15 с. Затем предметное стекло охлаждают, препарат тщательно промывают над зксикатором водой, после чего клетки в течение ЗО с докрашивают 0,5%-м водным раствором сафранина. Краситель сливают, препарат промывают водой, сушат и просматривают с иммерсионной системой (90 к — 100 к).
При правильном окрашивании вегетативные клетки имеют красный, а споры синий цвет. Вместо метиленового синею можно использовать другой краситель, например малахитовый зеленый. В этом случае после фиксации препарат заливают на 7 — 10 мин 7,5%-м раствором малахитовою зеленого. Окрашивание проводят с подогревом, помещая препарат нал сосудом с кипящей водой, и докрашивают клетки 0,25%-м водным раствором сафранина в течение 1 — 2 мин.
Споры окрашиваются в зеленый цвет, а вегетативные клетки в розовый. Эндоспоры можно также обнаружить с помощью фазово-контрастной микроскопии или методом простою окрашивания (например, фуксином). Они обладают многослойными трулнопроницаемыми для красителей оболочками, поэтому обнаруживаются в клетке в виде бесцветных включений. 522 б.
ВЫЯВЛЕНИЕ ВКЛЮЧЕНИЙ ПОЛИФОСФАТОВ (СИНОНИМЫ". ВОЛЮТИН, МЕТАХРОМА ТИН) Метод окраски основан на свойстве метахромазии — изменении цвета некоторых красителей (например, метиленового синего) прн взаимодействии с определенным комп о не н том клетки. Готовят тонкий мазок клеток БасгоЬаеуйиг де!Ьгиее!гй ли бар. Ьи!КаПсиг на предметном стекле, высушивают на возлухе, фиксируют в пламени горелки, заливают раствором метиленового синего по Леффлеру и окрашивают в течение 10 — !5 мин. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и просматривают с иммерсионной системой (90 — 100к). При этом клетки окрашиваются в голубой цвет, а гранулы полифосфатов в фиолетово-красный.
б. ВЫЯВЛЕНИЕ ВКЛЮЧЕНИЙ ГЛИКОГЕНОПОДОБНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ К капле слегка подкисленной суспецзии клеток дрожжей ЗассЬаготуеез еегегй!ае на предметном стекле добавляют каплю раствора Люголя. Препарат накрывакгг покровным стеклом и микроскопируют с объективом 40к.
Включения гликогеноподобного полисахарида окрашиваются в красно-коричневый цвет. 7. ВЫЯВЛЕНИЕ ВКЛЮЧЕНИЙ СЕРЫ Благодаря двойному светопреломлению включения серы хорошо заметны в клетках бебе!агоа зр., СЬотапит т!нигбиинит или некоторых лругих бактерий без специального окрашивания, для чего необхолимо приготовить препарат «раздавленная капля» и промикроскопировать его, пользуясь объективом 40к. Задание на доха с.
31 — Зб, 45 — 56. ТЕМА 2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И МЕТОДЫ С ТЕРИЛИЗА ЦИИ Занятие 4 и ""' Р " '~» гг "" "Р» мов, знакомство с методами стерилизации сред, посуды и инструментов. Задание Е. Приготовить по 150 — 200 мл питательной среды (БСА), содержащей мясопептонный бульон (МПБ) и 4 Б (с концентрацией сахара 4 градуса, определенной с помощью ареометра Баллинга) неохлгеленное пивное сусло (в соотношении 1:!) с 2% агара. Среду готовят в колбе объемом 300 — 700 мл.
Колбу с готовой средой ставят в кипящую водяную баню. После того, как агар расплавится н среда станет гомогенной, ее разливают в 7 — 8 широких пробирок (по 20 мл) и в 5 — 8 узких пробирок (по 5 мл). Пробирки с питательной средой закрывают ватными пробками и стерилизуют в авто- клаве при 0,5 ати. Среду после стерилизации используют при дальнейшей работе с микроорганизмами. Зидаиие 2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
