А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 156
Текст из файла (страница 156)
При наличии в среде нитритов появляется синее окрашивание. ° Качественная реакция на нитраты. На белой керамической пластинке несколько кристаллов дифениламина растворяют в капле концентрированной серной кислоты и к смеси добавляют каплю исследуемой жидкой культуры. При наличии нитратов возникает синее окрашивание. Контролем служит исходная сгерильная среда. Следует иметь в виду, что пробу на нитраты можно проводить только в отсуютвие нитритов, так как последние тоже дают синее окрашивание с дифениламином.
Изменение значения рИ среды определяют с помощью бромтимолблау (контролем служит исходная стерильная среда). Микроскопируют накопительную культуру в препарате «раздавленная капля». Отмечают морфологические особенности выросших бактерий и их подвижность. 1.7. Денитрифицирующие бактерии Занятие 5.
Используют среду следующего состава (г/л): лимоннокислый калий или натрий (трехзамещенный) — 5„0; КХО, — 2,0; КН,РО« — 2,0; МяБО« — 2,0; СаСО, — 0,2; 526 аспарагин — 1,0; ГеС1з — следы, вода водопроводная. Исходное значение рН среды— 6,8 — 7,2. Среду разливают в высокие пробирки, оставляя воздушное пространство в 1 см между пробкой и средой. Предварительно в каждую пробирку помешают стеклянный поплавок (запаянным концом вверх) так, чтобы он был полностью заполнен средой.
Посевной материал — почва. Среду в одной пробирке оставляют незасеянной для контроля. Пробирки помещают в термостат (ЗО С) на 1 — 2 нед. Заиятие 6. Проверяют рост накопительной культуры денитрифицирующих бактерий по ~азовыделению (пузырек воздуха в поплавке), отсутствию в среде нитратов, подщелачиванию среды (контролем служит исходная стерильная среда). О наличии или отсутствии нитратов судят по качественной реакции с дифениламином (см.
получение накопительной культуры нитрифицирующих бактерий). Изменение рН среды определяют с помощью бромтилюлблиу. Миироскопируют накопительную культуру в препарате «раздавленная каплягп Отмечают морфологические особенности выросших бактерий и нх подвижность. 1.8. Сульфатредуцирующие бактерии Заиятие 5. Используют среду следующего состава (г/л): КНзРО4 — 0,5; ХН«С! — 1,0; (ХН,)зЯО, — 7,0 или !ча,804 — 4,5; СаС1, — 0,06; лактат натрия — 6,0; лимоннокислый натрий (трехзамешенный) — 0,3; ХаС! — 5,0.
Для удаления из среды растворенного кислорода ее кипятят в колбе в водяной бане в течение 5 мин и затем осторожно охлаждают водой. После этого в среду вносят остальные компоненты в следующем порядке (мл/л): 1) 0,1%-й раствор ! е80«в 1%-м растворе НС! — 10,0; 2) дрожжевой экстракт — 10,0; 3) раствор микроэлементов (по Пфеннигу) — 1,0. Далее доводят значение рН до 7,0 — 7,5 с помощью 5%-х растворов ХаНСО, и НС! и добавляют Хаз8 9НзО (5%-й раствор в 1%-м растворе ХаНСО,) по каплям до образования сероватого оттенка в среде.
После этою в среду немедленно вносят посевной материал (почву), разливают доверху в пробирки и закрывают их резиновыми пробками. Пробирки помегдают в термостат (30 С) на 7 суг. Заиятие 6. Проверяют получение накопительной культуры сульфатредуцируюших бактерий по выделению сероводорода, который, связываясь с присутствующим в среде железом, вызывает ее почернение (контролем служит исходная стерильная среда). Микроскопируют накопительную культуру в препарате «раздавленная кап;и».
Отмечают морфологические особенности выросших бактерий, наличие спор (см. занятие 3) и подвижность. 1.9. Фототрофные пурпурные бактерии Заиятие 5. Пурпурные бактерии могут быть вьщелены из различных пресных н соленых водоемов. Для выделения несерных пурпурных бактерий готовят среду следующего состава (г/л): ХН,С1 — 1,0; КН,РО« — 0,5: М8С!з — 0,5; микроэлементы по Пфеннигу — 1 мл. К основному фону среды добавляют (г/л): НаНСО« 2,0; Хаз8— О,!5; ацетат, лактат или малат натрия — 2,0; дрожжевой экстракт — О,!.
Исходное значение рН среды доводят до 7,0 с помощью 10%-х стерильных растворов НаОН и НзРОм В пробирку (или колбу) с притертой пробкой вносят 5 — 10 % (по объему) посевного материала (воду или ил из различных водоемов) и доливают до пробки средой так, чтобы между средой и пробкой не оставалось воздушного пространства. Пробирки (или колбы) помещают в люминостат (800 — 1000 люкс, 28 — ЗО С) на 1 — 2 нед. 527 Занятие 6.
Проверяют получение накопительной культуры пурпурных бактерий по окрашиванию среды в розовый, красный или коричневатый цвет, благодаря наличию большого количества каротиноидов. Милросколируютл накопительную культуру в препарате «раздавленная капля». Отмечают морфологические особенности выросших бактерий, их подвижность. 1 10. Микроорганизмы, использующие углеводороды Загптнтие 5. Используют среду следующего состава (г/л): К)т'Оз — 4,0; КЕ1,РО, — 0,6; )ЧатНРО« — 1,4; М880» — 0,8; вода водопроводная. Исходное значение рН срелы доводят до 6,8 — 7,2 растворами (т!аОН и НС! (проверяют по бромтимолблау).
В две качалочные колбы обьемом 750 мл помещают по 100 мл среды. В одну из колб вносят около 1 г почвы, отобранной у бензоколонки, и 2 мл керосина, а в другую — такое же количество почвы и 2 мл вазелинового масла. Колбы закрывают ватными пробками и помещают на качалку (220 об/мин) при 30 С на 5 — 7 суг. Занятие 6. Проверяют получение накопительной кулыуры углеводородокисляющих микроорганизмов по помутнению среды и наличию пленки на ее поверхности (контролем служит исходная стерильная среда). Микросколируюлт накопительную культуру в препаратах «раздавленная капля» и фиксированных окрашенных (фуксином) клеток.
Отмечают морфологические особенности выросших бактерий, их подвижность. 1.11. Аммонифицирующие бактерии Заггятие 5. Для получения накопительной культуры используют мясо-пептонный бульон. 30 мл среды наливают в колбу емкостью !00 мл, добавляют 0,3 г почвы и закрывают ватной пробкой. Для обнаружения аммиака над средой в колбе мелсду стенкой и пробкой подвешивают красную лакмусовую бумажку, смоченную дистиллированной водой (бумажка не должна касаться среды). Сверху колбочку закрывают пергаментной бумагой и ставят в термостат (30'С) на 4 — 6 суг. Заняитие 6.
Проверяют получение накопительной культуры аммонифицируюших бактерий по посинению лакмусовой бумажки и запаху сероводорода. Микроскоттир)лота накопительную культуру в препаратах «раздавленная капля» и фиксированных окрашенных (фуксином) клеток. Отмечают морфологические особенности выросших бактерий „их подвижность. Свойства всех полученных накопительных культур бактерий (1.1 — 1.10) обобщают в табл. П.1. Таблица П.1 Свойства накопительной культуры бактерий Морфология клеток Кулыуральные признаки Среда 2. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ Для вьщеления чистых культур микроорганизмов из накопительных обычно используют метод Коха. Принцип его заключается в получении чистой культуры вз отдельной колонии.
Выделение чистых культур аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов проводят, рассевая накопительную культуру на поверхность твердой 528 питательной среды. В зависимости от свойств накопительных культур микроорганизмов для подучения отдельных колоний используют разные среды: ° спаравые аэробные бактерии — БСА (МПБ с суслом, 1: 1, м 2% агара); ° денитрифииирующие бактерии — БСА; ° урабактерии — МПА с 2% мочевины; ° мегтиотрафные бактерии — агаризованную среду с метанолом; ° уалеводародокисггяюгяие бакгперии — БСА; ° аэатфиксирующие аэрабные бакягерии — агвризованную среду Эшби; ° аягмонифияирующие бактерии — М ПА. Заиягпие 5. Посев проводят бактериологической петлей методом яистощающеео шгггрихаж Чашки с посевами бактерий (крышками вниз) помешают в терлгостат (30 С) на 4 — б сут.
Занятие 6. Выбирают и описывают 2 изолированные колонии микроорганизмов, выросшие на поверхности питательных сред. Расяливляют на кипящей водяной бане соответствующие стерильные среды в пробирках (по 1 — 2 пробирки каждой среды) для разных бактерий (см. 2.1). Скашивают среды и делают посев в них из двух описанных колоний микроорганизмов. Посев проводят штрихом бактериологической петлей, простерилизованной в пламени горелки.
Пробирки помещают в термостат (30 С) на 3 — 5 суг. После того, как культуры в пробирках вырастут, праверягат чистоту выделенных кулыпур визуально (однородный рост по всему штриху) и микроскопированием (чистые культуры многих бактерий морфологически однородны, допустимо лишь некоторое варьирование размеров клеток). Необходимо также провести рассев на твердую среду (БСА) в чашки Петри. Однородность колоний и совпадение их признаков с описанными ранее — свидетельство чистоты культуры. Следует иметь в виду, что некоторые виды бактерий могут образовывать колонии разной морфологии в результате процесса диссоциации.
Задание на дам: с. 114 — 117, 132 — 142. ТЕМА 4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ (ЗАНЯТИЯ 7 — 10) г~ч Ы=го:гганизмов. В процессе выполнения практической работы каждый студент изучает свойства бактерий, необходимые для описания бактериального штамма и идентификации его до уровня рода. Занятие 7 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСТОТЫ ИДЕНТИФИЦИРУЕМОЙ БАКТЕРИИ И ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ КЛЕТОК Для проведения работы по идентификации микроорганизмов каждый студент получает одну культуру бактерий (на скошенной агаризованной среде в пробирке)„которую затем проверяет на чисготу.
Это осуществляют несколькими способами: визуально, высевом на питательные среды и микроскопией. Просивглривпют харикгвер роста полученной бактерии по штриху на поверхности скошенной агаризованной среды. Если рост по штриху неолнороден, то культура загрязнена. Затем культуру отвевают в пробирку на скошенную среду (МПА, БСА) лля использования в лальнейшей работе, а также делают рассев на поверхность твердой среды в чашке Петри методом истоглающего штриха для проверки на чистоту (по однородности выросших колоний). Засеянные пробирки и чашки помещают в термастат (30 С) на 2 — 3 сут. Остаток исходной культуры бактерии в пробирке используют для проверки на чистоту методом микроскопии (по морфологической однородности популяции), а также изучения формы, взаимного расположения, подвижности клеток и их размеров. Микдосколируьлл культуру с использованием препаратов <раалавленная капляь и препарата фиксированных, окрашенных фуксином клеток (см.
занятия 1 н 2). Результаты вносят в табл. П.2. Таблица П.2 Свойства идентифицируемой бактерии 13ризиака Результаты Описание колонии Форма Размер, мм Цвет Край Блеск Поверхность Профиль Рисунок Морфология клеток и цитология Форма и расположение клеток Подвижность Наличие эндоспор Окраска по Граму Окраска на кислотоустойчиаость Физиолого-биохимические свойства Рост на среде с глюкозой Протеолитическая активность: рост на среде с желатином рост на среде с молоком Амилазная активность: рост на среде с крахмалом Тест на каталазу Тест на оксидазу Чувствительность к антибиотикам 530 2.
КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА На следующем занятии просматривают чашку Петри, засеянную суспензией идентифицируемой бактерии. Критерием чистоты культуры (при отсутствии диссоциации) является однородность выросших колоний. Описывают культуральные (макро-морфологические) свойства бактериальных колоний и результаты вносят в табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
