А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 157
Текст из файла (страница 157)
П.2. ~дд: . Тб, «Г — 129. Занятие 8 3. ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОЛОГИ ЧЕСКИХ СВОЙСТВ иденТиФициРуеиых БАктеРий 3.1. Наличие эидоспор Наличие эндоспор в клетках определяют, как описано выше (см. занятие 3). 3.2. Окраска по Граму На обезжиренном предметном стекле в каплях воды делают мазки трех микроорганизмов: в центре готовят мазок клеток исследуемой бактерии, а слева и справа— контрольных бактерий. Клетки одной из контрольных бактерий должны быть грамположнтельными, например М!сгососсиз!яГеяг, другой — грамотрицательными, например Езслег(сл!а со10 Мазки следует готовить тонкими, чтобы клетки равномерно распределялись по поверхности стекла и не образовывали скоплений.
Препараты высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1 — 2 мин карболовым генциановым или кристаллическим фиолетавыль Затем краситель сливают и мазки обрабатывают 1 — 2 мин раствором Люголя до почерпения. Сливают раствор Люголя, препарат обесцвечивают 0,5 — 1,0 мин 96%-м этиловым спиртом, быстро промывают водой и дополнительно окрашивают 1 — 2 мин водным фуксином.
Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Прн правильном окрашнвании грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый, грамотрицательные — розово-красный цвет. Для получения достоверных результатов необходимо готовить мазки для окраски по Граму из молодых, активно растущих (обычно односуточных) культур, так как клетки из старых культур иногда дают неустой сивую реакцию по Граму. Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальпая пленка (мазок) слишком толста и обесцвечявание спиртом не проведено до конца.
Грамположительные бактерии могут выглядеть как грамотрицательные, если мазок псреобесцвечен спиртом. Для сравнения можно использовать ускоренный шест для определения принадлежности бактерий к грамположительпым нли грамотрицательным видам. Для этого исследуемую культуру бактерий с помощью петли переносят с твердой среды на предметное стекло в каплю 3%но раствора КОН и тщательно перемешивают. Через 10 с петлю поднимают над каплей. Для грамотрнцательных бактерий характерно образование слизи ДНК„которая тянется за петлей на 0,5 — 1,0 см. Если образование слизи не наблюдается, бактерии относятся к грамположнтельным.
Образование слизи происходит в результате разрушения клеточных стенок грамотрицательных бактерий и выхода из них нуклеиновых кислот. 531 3.3. Окраска на киспотоустойчивость На обезжиренном предметном стекле в каплях воды готовят два мазка: исслелуемой бактерии и кислотоустойчивых микобактерий (МусоЬасмгшт 77агезсеги). Препараты высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. На мазки помещают фильтровальную бумагу, заливают препараты карболовым фуксином Циля и 2 — 3 раза подогревают их до появления паров, держа предметное стекло с помощью пинцета высоко над пламенем горелки. За появлениел» паров наблюдают, глядя на мазок сбоку, и при их появлении тотчас отставляют препарат в сторону.
Дают препаратам остыть, снимают фю~ьтровальную бума~у, сливают краситель и мазки промывают водой. Затем клетки обесцвечивают 5%-м раствором НзБОь Для этого предметное стекло погружают 2 — 3 раза в стакан с серной кислотой, не задер>кивая его в ней. Препарат вновь тщательно промывают водой и докрашивают 3 — 5 мин метиленовым синим (по Леффлеру). Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают и рассматривают с имл~ерсионной системой.
При правильном окрашивании кислотоустойчивых бактерий клетки имеют красный цвет, а некислотоустойчивые — синий. 4. ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИДЕНТИФИЦИРУЕМЫХ БАКТЕРИЙ 4АК Рост на среде с глюкозой и пептоном Культуру вносят стерильной петлей в жидкую среду, содержащую (г/л): пептон— 5,0; К,НРО, — 1,0; глюкоза — 10,0; бромтимолблау — 2 мл (1,6% спиртового раствора), вода дистиллированная, разлитую в пробирки (по 3 — 10 мл) с поплавками. Продолжительность культивирования 7 суг в термостате на 30'С. Рост микроорганизмов или его отсутствие определяют по помутнению среды, образованию пленки или осадка. Изменение цвета индикатора (бромтимолблау) указывает па образование кислых (желтая окраска среды) или щелочных (синяя окраска среды) продуктов метаболизл1а.
Об образовании газа свидетельствует накопление его в поплавке. Результаты наблюдений сравнивают со стерильной средой. 4.2. Рост на среде с желатиной Активнскть у микроорганизмов внеклеточных протеолитических ферментов определяют, используя в качестве субстрата желатин, казвин или другие белки. Среда с желатином состоит из МПБ и 1Π— 15 % желатина (МПЖ). Посев проводят уколом.
Бактериологической иглой стерильно отбирают клетки микроорганизмов с косяка и вводят иглу в толщу столбика МПЖ до дна пробирки. Продолжительность культивирования 7 — 10 сут при комнатной температуре. Разжижение желатины или его отсутствие отмечают визуально. 4.3. Рост на среде с молоком Высев на «молочный агар» в чашки Петри производят для определения способности бактерий разлагать казвин молока. Среда состоит из равных частей стерильного обезжиренного молока и стерильного 3%-го водного агар-агара. Бактерии высевают петлей, проводя штрих по диаметру чашки или по центру сектора, на которые разделена чашка.
Продолжительность культивирования бактерий в термостате при 30 С 7 сут. Гидролиз казвина обнаруживают по зоне просветления среды вокруг колоний или вырос- 532 шей по штриху культуры микроорганизмов. Особенно четко зона видна после обработки среды с выросшими бактериями раствором 5%-й трихлоруксусной кислоты. Зону гидролиза казвина измеряют в мм от края штриха или колонии до границы светлой зоны. Чем больше диаметр светлой зоны, тем выше казеинолитическая активность бактерий. 4.4.
Рост на среде с крахмалом Высев на агаризованную среду с крахмалом (в чашки Петри), содержащую (г/л): пептон — 10,0; КНьр04 — 5,0; растворимый крахмал — 2,0; агар — 15,0; рН 6,8 — 7,0 производятдля определения образования мик1кюрганизмами амилазы. Бактерии высевают петлей, проводя штрих по диаметру чашки или по центру сектора, на которые разделена чашка. Продолжительность культивирования бактерий 7 сут в термостате при 30 "С.
Гилролиз крахмала обнаруживают после обработки среды с выросшими бактериями раствором Люголя. Для этого на поверхность среды наливают 3 — 5 мл раствора Люголя. Среда, содержащая крахмал, окрашивается в синий цвет, а зона гидролиза остается бесцветной или приобретает красно-бурую окраску, если крахмал гидролизовался до декстринов. Зону гидролиза крахмала измеряют от края штриха (колонии) до границы светлой зоны (мм).
Чем больше диал1етр светлой зоны, тем выше активность амилазы, 4.5. Тест на каталазу Часть выросшей культуры суспензируют с помощью бактериологической петли в капле 3% перекиси водорода на предметном стекле. О наличии каталазы свидетельствует образование пузырьков газа, наблюдаемое через ! — 5 мин после внесения бактерий невооруженпылг глазом или в микроскопе при лгалом увеличении. Можно нанести несколько капель перекиси водорода непосредственно на колонию или на культуру, выросшую на скошенном агаре, и наблюдать выделение молекулярного кислорода.
4.6. Тест на оксидазу Наносят несколько капель 1%-го свежеприготовленного раствора солянокислого тетраметил-в-фенилендиамина на отрезок фильтровальпой бумаги. Суточную культуру бактерий распределякгг по поверхности увлажненной этим раствором бумаги. При положительной реакции через !Π— 20 с развивается фиолетовая или пурпурная окраска. Задание на3~м: с. 129 — 132, 159 — 167. Занятие 9 5.
УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ Учесть результаты опытов по изучению физиологических и биохимических свойств бактерий„проведенных на предыдущем занятии, и внести в табл. П. 2 6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИИ К АНТИБИОТИКАМ Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам можно проводить методом агаровых блочков и с помощьк> бумажных дискон, пропитанных разны- 533 ми антибиотиками. Дги этого готовят в стерильной водопроводной воде густую суспензию изучаемого микроорганизма путем смыва клеток водой с поверхности твердой питательной среды.
Работая около пламени горелки, вносят по 3 — 5 капель полученной суспензии в пробирку с предварительно расплавленной и остуженной до 45 — 50 'С питательной средой (БСА). Содержимое пробирки тщательно перемешивают и переливают в стерильную чашку Петри. В качестве продуиентов антибиотиков используют бактерии рода Бггерготусез (табл. П.З). Продуценты антибиотиков предварительно выращивают на агаризованных средах в чашках Петри сплошным газоном. Стерильным пробочным сверлом (диаметр б — 8 мм) вырезают блочки с газона микроорганизма и переносят их на поверхность застывшей среды, засеянной изучаемой бактерией.
Бумазсные диски, пропитанные разными антибиотиками (вьщает лаборант), помешают на поверхность засеянной бактерией среды на равном расстолнии друг от друга и на 1,5 — 2,0 см от края чашки. Чашки Петри, не переворачивая, помещая>т в термостат (30*С) на 24 ч. Через сутки отмечают образование зон подавление роста исследуемых микроорганизмов вокруг атаровых блочков и дисков. Если исследуемая бактерия чувствительна к определенным антибиотикам, то вокруг блочков или дисков обнаруживаются зоны отсутствия роста культуры.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
