А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 158
Текст из файла (страница 158)
Диаметр зоны подавления роста измеряют миллиметровой линейкой и записывают результаты в табл. П.З. Зона более 30 мм свидетельствует о высокой чувствительности микроорганизмов к антибиотику, а менее 12 мм — о слабой чувствительности. Таблица П.З Действие антибиотиков ва рост бактерии Антибиотик Диаметр зон подавления роста, мм Диск с пенициллином Диск с левомицетином Блок с Б. Ио!асеиз (мицетин) Блок с Ю. апи(огиз наг. 8пзеиз (стрептомицин) Блок с Х опи1агиз наг.
зрдаего1дез (новобиоцин) Блок с Б. апи!а1из наг. с1лузота11из (актнномицин) Задание на дои: с. 101 — 113. Занятия '10 — 1'1 7. ПОДВЕДЕНИЕ ИТОГОВ Оформить сволную таблицу о свойствах изучаемой бактерии. Провести цаентификагшю изучаел~ой бактерии по определителю Берлжи. Результаты определения и таблицу со свойствами бактерии сдать преподавателю. ТЕМА 5 МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ 534 1. МЕТОД КОХА Расплавляют в кипящей водяной бане 20 мл ранее приготовленной стерильной среды (БС<х) в трех пробирках и разливают ее в три стерильные чашки Петри около пламени горелки.
Когда среда застынет, делают высел из полученной от преподавателя культуры дрожжей Басс<<си<тугах сегеизлле для определения числа живых клеток. С этой целью готовят разведения исходной культуры в десять и сто раз в стерильной водопроводной воде. Для этого стерильной пипеткой 1 мл исходной культуры внослт в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. Суспензию этого разведения (1: 10) тщательно перемешивают с помощью новой стерильной пипетки, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь.
Эту процедуру повторяют 3 — 5 раз, что обеспечивает перемешивание суспензии и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем новой стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии полученного разведения и перенослт во вторую пробирку получая второе разведение 1:100. Производят посев из исходной культуры и полученных разведении путем нш<ессния каждый раз новой стерильной пипеткой по 0,1 мл суспензий (предварительно ти<ательно размешанной) иа поверхность агаровых пластинок в чашках Петри. Посевной материал тщательно распределяют по поверхности агаризованной среды стерильными шпателями Дригальского. Для исходной культуры и полученных разведений берут каждый раз новый стерильный шпатель.
Чашки Петри и пробирки, засеянные микроорганизмами, помещают в термостат (30 'С) на 3 — 5 сут. Чашки Петри инкубируют в термостате крышками вниз. На следующем занял<ии подсчитывают число колоний 5. сегегй<се в чашках Петри, и делают пересчет для определения общего числа живых клеток в 1 мл суспензии по Формуле и 1О" М=— и где М вЂ” количество клеток в 1 мл; а — среднее число колоний при высеве данного разведения; !Π— коэффициент разведения; л — порядковый нол<ер разведения, из которого сделан высев; К вЂ” объем суспензии, взятый для посева. 2 НЕФЕЛОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД Плотность клеток 5. сегегйше в жидкой среде определяют нефеломстрическн (ФЭК), используя кювету с длиной опти <еского пути 0,5 см и зеленый светофильтр (Ь = ).
540 нм). Ддя получения достоверных результатов плотность клеток должна быть в пределах 0,!в 0,6. При концентрациях клеток выше 0,6 происходит вторичное рассеяние света, что приводит к получению заниженных результатов. Поэтому суспензии больших плотностей перед измерением светопропускания следует разводить водой в 2, 4, 6, 8 и 1О раз. Результаты измерений оптической плотности каждой суспензии (контролем служит вода) записывают в табл. П.4. 3. ПОДСЧЕТ КЛЕТОК В КАМЕРЕ ГОРЯЕВА-ТОМА Для перехода от показаний Фотоэлектроколориметра (ФЭК) к количеству клеток микроорганизмов в среде подсчитывают их число, пользуясь счетной камерой Горяева-Тома и разведениями суспензии дрожжей, которые использовали для определения их плотности нефелометрическим л<етодом. Клетки подсчитывают в больших квадратах сетки, пользуясь обьективом 8х.
Общее число подсчипшных клеток должно быть не 535 менее бОО. Количество клеток в 1 мл соответствующей суспензии рассчитывают по формуле !000 а.л 5 Б где М вЂ” число клеток а 1 мл суспензии; а — среднее число клеток в большом квадрате сетки; л — глУбина камеРы ('/!с мм); ю — площадь большого квадРата сетки ('/и мм'); л — степень разведения суспензии; 1000 мм' — 1 мл. Полученные результаты, млн клеток в 1 мл (записывшот в табл.
П.4). Таблица П4 Количество клеток дрожжей в суспензиях, установленное с помощью камеры Горяева, и соответствующие показания ФЭК 4. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Построить калибровочную кривую на основании данных табл. П.4, откладывая на оси абсцисс количество клеток лрохскей„а на оси ординат оптическую плотность соответствующей суспензия. Калибровочную кривую строят для быстрого определения количества клеток определенного вида микроорганизмов по показаниям ФЭК, Сравнить количество клеток дрожжей в 1 мл. Определенное подсчетом а камере Горяева (табл. П.4) и методом Коха.
Сделать вывод о соотношении живых и мертвых клеток дрожжей в исходной суспензии. 5. ЗАЧЕТ ЛО КУРСУ ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ (ТЕМЫ 1 — 5) ПЛАН СЕМИНАРСКИХ ЗАНЯТИЙ Практикум рекомендуется дополнить семинарскими занятиями. Примерные вопросы для обсуждения следующие: ЗАНЯТИЕ 1 Тема. Цитологии и систематика микроорганизмов 1. Строение прокариотической клетки. 2. Клеточные стенки прокариот. 3.
Дифференцированные клетки бактерий. Спорообразование. 4. Основные филогенетические группы организмою археи, бактерии, зукарии. 5. Теория симбиогенеза. 536 ЗАНЯТИЕ 2 Тема. Метаболизм микроорганизмов 1. Анабаяизм и катаболизм. Типы питания микроорганизмов. Общая схема обмена веществ у лщкроорганизмов. Особенности метаболизма аэробов и анаэробов. 2. Дыхание и брожение.
Виды анаэробного дыхания. 3, Хечосинтез. 4, Фотосинтез у прокариот. 5. Физиологические группы микроорганизмов. б. Жизнь микроорганизмов в экстремальных условиях, ЗАНЯТИЕ 3 Тема. Микроорганизмы в биосфере 1. Участие микроорганизмов в циклах С, 1'4, В и других элементов. 2. Взаимодействие микроорганизмов. Трофическая цепь. 3. Симбиозы. 4. Нормальная микрофлора человека. 5. Санитарно-бактериологический анализ пищевых продуктов, воды и воздуха.
Микробное число, коли-титр, коли-индекс. б. Участие микроорганизмов в приготовлении и порче пищевых продуктов. 7. Участие микроорганизмов в процессах очищения окружающей среды. На занятии можно также просмотреть препараты микроорганизмов, приготовленные из квашеной капусты, кисломолочных продуктов, чайного гриба и других субстратов.
ПРИЛОЖЕНИЕ 2 УСТРОЙСТВО ПРИБОРОВ И ПРИНЦИПЫ РАБОТЫ НА НИХ ОСНОВЫ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ Центрифугирование может заменить фильтрование и применяется лля разделения смесей, где один из компонентов — хощкость. Центрифугирование позволяет избежать многих трудностей, связанных с фильтрованием, например засорения пор фильтра мелкодисперсными частицами, адсорбции частиц на фильтре, дает возможность разделять сл~еси веществ, портящихся от соприкосновения с фильтром, и значительно повышает скорость разделения смесей. Методом дифференциального центрифугирования в биологии достигается разделение содержимого кдеток на компоненты: ядра, митохондрии, рибосомьь После разрушения клеток микроорганизмов или тканей животных и растений получаются гомогенаты, содержащие все клеточные компоненты, различающиеся между собой относительной молекулярной массой.
В основе метода центрифугирования лежит принцип отделения крупных частиц с большей плотностью 537 прн низких скоростях. При повышении скорости центрифугирования можно осадить все более и более мелкие частицы. Подбирая свойства жидкости в смеси и силу осаждения, можно направленно вьшелять отдельные клеточные компоненты. Особенно зто важно при так называемом градиентном центрифугированни, когда осаждение ведется в смеси, где жидкость имеет самую низкую удельную плотность у верха центрифужной пробирки, а самую высокую— в ее нижней части. Наслаивая на поверхность жидкости в пробирке клеточные гомогенаты, подвергаемые разделению в процессе длительного центрифугирования, можно зтолучить картину распределения клеточных компонентов слоями, которые соответствуют плотности жидкости на данной высоте пробирки. Аналитическое центрифугирование применяется для определения коэффициента седиментации и связанной с ним молекулярной массы различных веществ, например белков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
