А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 155
Текст из файла (страница 155)
Налить водопроводную воду в 4 — 5 узких пробирок (по 1О мл). Пробирки закрывают ватными пробками и стергпизуют в авгоклаве при 1 ати. Стерильную воду используют затем для приготовления суспензнй микроорганизмов. Задание 3. Подготовить к стерилизации сухим жаром: 523 чашки Петри — 9 шт. (по 3 в пачку); пипетки на 1 — 2 мл — 4 — 5; на 5 мл — 1 — 2 шт.; пробирки обычные — 4 шт.; стеклянные шпатели (Дригальского) — 3 шт. Посуду и инструменты стерилизуют в сушильном шкафу при 165 — 170' С в течение 2 ч. Задание 4. Сделать ватно-марлевые и!юбки для нескольких пробирок.
Задияие 5. Познакомиться с устройством автоклава, «««««: . 3« — ««9« — 1«1, 159 — ««7. ТЕМА 3. ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХ И ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ Занятии 5 — 6 Ш««««яૠ— «: «» «г «««««« 1. ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ 1.1. Свободноживущие азробные азотфиксирующие бактерии Занятие 5.
Используют среду Эшби, не содержащую соединений азота, (г/л): маннит — 20,0; КзНРО4 — 0,2; М880х — 0,2; ХаС! — 0,2; КТО« — 0,1; СаСО, — 5,0; агар— 20,0. Вода дистиллированная. Среду в колбе расплавляют на водяной бане, разливают в стерильные чашки Петри и дают остыть на горизонтальной поверхности. Затем, пользуясь стеклянным капилляром, смоченным в воде, раскладывают на поверхность среды в чашке (по трафарету) 15 — 25 комочков почвы величиной с булавочную головку. Чашку Петри закрывают и ставят в термостат (30'С) на 3 — 5 сут. Вместо агара в качестве уплотнителя среды можно также использовать силикагель.
В этом случае готовят 10- кратно концентрированную среду Эшби. Этой средой пропитывают пластинки силикагеля (2 — 3 мл на чашку), подсушивают в сушильном шкафу (10 — 15 мин при 60'С) и раскладывают комочки почвы. Занятие б. Проверяют получение накопительной культуры азотфиксируюших бактерий по образованию слизистых колоний (при длительном росте часто окрашенных в коричневый цвет) вокруг комочков почвы на чашках. Микроскопируют накопительную культуру с использованием метода негативного контрастирования (см. занятие 3). Обнаруживают клетки бактерий (обычно представителей репа Агогобакгег или ВебепнсГбо), окруженные слизистой капсулой.
1.2. Свободноживущие аназробные азотфиксирующие бактерии Занятие 5. Используют среду Виноградского следующего состава (г/л): глюкоза— 20,0; КзНРО4 — 1,0; М83О4 — 0,5; )4аС1 — 0,5; Мл804 и РеЯОх следы; СаСОз — 20,0. Вода водопроводная. В высокие пробирки вносят небольшое (0,5 — 1,0 г) количество почвы, наливают среду Виноградского, оставляя воздушное пространство в 1 см между пробкой и средой, и пастеризуют в течение 10 мин при 80 С (в водяной бане).
Пробирки помешают в термостат (30'С) на 7 сут. На этой среде, как правило, вырастают клостридии, обычно Иоипг(!ит роиеипаиит. Занятие б. Проверяют получение накопительной культуры азотфиксирующих клостридий по газовыделению и запаху масляной кислоты (контролем служит исходная стерильная среда). 524 Микросконируют накопительную кулыуру. Отмечают наличие подвижных палочек, образующих споры. В клетках бактерий выявляют характерные гранулы крахмалоподобного вещества (гранулезы). Для этого к капле суспензии клеток па предметном стекле добавляют каплю раствора Люгосся.
Препарат накрывают покровным стеклом и микро- скопируют с объективом 40х. Включения гранулезы окрашиваются в синий цвет. 1.3. Аэробные спорообразующие бактерии Вариант 1. Занятие 5. Нарезают неочищенный клубень картофеля на мелкие ломтики, помещают их в колбу объемом 100 — 150 см, добавляют небольшое количество СаСО, (на кончике шпателя), заливают ломтики водопросюдной лолой (с таким расчетом, чтобы вода покрывала их примерно наполовину), закрывают колбочку ватной пробкой и прогрессакст в кипящей водяной бане 10 — 15 мин. При этом вегетативные клетки бактерий, находящихся на поверхности клубней картофеля, погибают, а жизнеспособными обычно остаются лишь термостабильные споры.
Колбы помешают в термостат (30'С) на 5 — 7 сут. За>сятие б. Проверяют получение накопительной культуры спорообразуюших бактерий (обычно рода ВасИиг) по появлению на поверхности среды морщинистой пленки. Для микроокоиирования готовят препараты фиксированных окрашенньсх клеток. Отмечают наличие эндоспор. Для этого препарат фиксированных клеток окрашивают фуксином в течение 2 — 3 мин.
Цитоплазма окрашивается в розово-красный цвет, а спора не окрашивается фуксином и видна в клетке в виде бесцветного включения. Можно также провести дифференциальную окраску спор и цитоплазмы (занятие 3). Вариант 2. Заяя>яие 5. Помещают! г сена в колбочку объемом 100 — 150 мл и заливают 20 — 30 мл водопроводной воды„нагретой до 40 — 50'С. Сено настаивают в течение 30 мин. За это время вз сена экстрагирукпся вещества, которые служат питательным субстратом для бактерий.
Через 30 мнн сенной настой отсселяют от сена декантацией, разливают в 2 пробирки (примерно по 5 — 7 мл), закрывают их ватными пробками и прогревают в кипящей водяной бане 15 — 20 мин. При этом лишь споры некоторых бактерий остаются жизнеспособными. Колбы помешают в термостат (30'С) на 7 сут. Занятие б. Проверя>от получение накопительной кульзуры спорообразуюших бактерий (обычно Вас!!!ив виб>>1>я) по наличию в накопительном материале эндоспор методом мсскросконирования (см. вариант 7).
1.4. Уробактерии Заяятие 5. К 25 мл мясопептонного бульона (МПБ) добавляют 2,5 г (10%) моче- вины. Полученную среду разливают в обычные пробирки (по 5 — б мл) и инокулируют небольшим количеством навоза. В такой среде развиваются бактерии (обычно Вас>бис ра>>екпс', Вропиагста игеае или Ргосеив ги!яаг!в), способные разлагать мочевину с помощью уреазы согласно уравнению: СО(1ЧН>)> + Н,О +~ СО, + 214Н, В результате рН среды повышается до тех значений (9 — 10), при которых сохраняют способность расти преимущественно уробактерии. Большинство других бактерий из-за высокого значения рН не растут.
Для получения накопительной культуры уробактерий пробирки помешают в термастат (30'С) на 7 суг. За>сятие б. Проверяют рост накопительной культуры уробактерий по выделению аммиака и подшелачиванию среды (контролем служит исходная стерильная среда). Микросконируюпс накопительную культуру с фазово-контрастным устройством в препарате «раздавленная капля». Отмечают морфологические особенности выросших бактерий, их подвижность, наличие в клетках спор (см. занятие 3). 525 1.5. Метилотрофы Занятие 5. Метилотрофы, использующие метанол, легко выделяются из сточных вод и других источников, где этот субстрат часто присутствует.
Для получения накопительной культуры метилотрофных бактерий используют синтетическую среду Канеда следующего состава (г/л): КНгРО4 — 2,0; (ХН4)гЗО« — 2,0; ХаС! — 0,5; МАКО« — 0,025; Ре50« — 0,01. Вода водопроводная. В качалочную колбу объемом 750 мл помещают 100 мл среды, 4 капли 10%-го дрожжевого экстракта и 0,3%-го (по объему) метанола.
С помощью 10%-х растворов ХаОН и НП доводят значение рН среды ло 7,0. Затем в колбу вносят 3 — 4 мл сточной жидкости или другой образец природного материала. Колбу помешают на качалку (200 об/мин) и оставляют при 30 С на несколько суток. Занятие б. Проверяют получение накопительной культуры метилотрофных бактерий по помутнению и часто появляющемуся розовому окрашиванию среды (контролем служит исходная стерильная среда). Л/икроокопиругот накопительную кулгпуру в препарате «раздавленная капля».
Отмечают морфологические особенности выросших бактерий, их подвижность. 1.6. Нитрифицирующие бактерии Занятие 5. Используют среду Виноградского следующего состава (г/л): (ХН«)«Ю«вЂ” 2,0; К,НРО« — 1,0; МАКО« — 0,5; Ре504 — 0,4; ХаС! — 2,0. Вода водопроводная. Среду разливают в колбы объемом 50 мл по 15 мл в каждую (высота слоя среды должна быть 1,0 — 1,5 см). В каждую колбу вносят на кончике шпателя неболылое количество СаСО,. Посевным материалом служит почва. Колбы помешают в термостат на 30 *С. Через 7 — 3 недели проверяют получение накопительной культуры нитрификаторов по появлению в среде нитритов и (или) нитратов. Для их обнаружения проводят качественные реакции на нитриты с реактивом Грисса или с помощью крахмал-йодной реакции и на нитраты с дифениламином.
Развитие нитрифицируюших бактерий приводит также к подкислению среды. ° Качественные реакции на нитриты. Для обнаружения нитритов к капле реактива Грисса на керамической пластинке добавляют каплю выросшей жидкой культуры. Появление красного окрашивания свидетельствует о присугствии нитритов. ° Крахмал-йодная реакция основана на том, что нитриты в кислой среде окисляют йодистый цинк с вьшелением йола, присутствие которого обнаруживают с крахмалом. Для проведения реакции к капле выросшей жидкой культуры на керамической пластинке добавляют каплю раствора, содержащего г.пС1,, К1, крахмал и каплю 5%-го раствора НС!.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
