А.И. Нетрусов, И.Б. Котова - Микробиология (1125593), страница 47
Текст из файла (страница 47)
Содержание различных хлорофиллов можно измерять и по спектрам флуоресценции. Концентрация ДНК в клетках микроорганизмов довольно постоянна, поэтому ее определение также может способствовать измерению биомассы. В природных образцах, где чувствительность метода определения ДНК имеет первостепенное значение, применяют пробы с флуоресцентными красками, такими, как этидиум бромид или Ноес)за 33258 с использованием спектрофлуорометрии.
Перед измерением необходимо провести тщательную очистку тотальной ДНК, а также контроль на наличие эукариотической ДНК. 259 Белок определять легко, а бактериальные гемопротеины имеют характерную хемилюминесценцию. При определении белка следует убедиться, что фоновые концентрации белков незначительны. Поскольку различные микроорганизмы содержат разные количества белка, определение этого компонента биомассы целесообразно проводить в ситуациях, когда в пробе присутствует один вид микробов. Наличие лииидоо служит хорошим маркером для определения биомассы, поскольку все клетки окружены мембранами, содержащими липиды.
Количество эргостерола в пробе отражает содержание грибов, поскольку его практически не содержат ни растения, ни археи с бактериями. Определение концентрации и состава метиловых эфиров жирных кислот фосфолипидов позволяет наряду с оценкой общей биомассы найти концентрацию той или иной группы микроорганизмов в образце, взятом из природных ниш.
Физиологические методы определения биомассы основаны на измерении дыхания пробы после добавления субстрата или на измерении количества СО,, выделившегося в результате разложения микробной биомассы после стерилизации пробы при добавлении хлороформа. Оба метода требуют проведения многочисленных проверок. Количественная оценка метаболизма микроорганизмов Последние лостижения в аналитической методологии позволяют измерять метаболическую активность микроорганизмов в их природных экологических нишах, однако при постановке опытов следует учитывать возможные возмущения микроокружения клеток при введении измеряющих объектов. Так, простое ограничение микрониши стенками может вызвать пристеночный эффект, а отбор проб из ограниченного пространства — нарушить газовый баланс (содержание кислорода).
Все это приводит к снижению точности и воспроизводимости результатов измерений. Определение гетеротрофного потенциала данной экониши ведут при изучении включения радиоактивной метки (обычно мС) из введенных в образец меченых гетеротрофных субстратов. Этот подход предполагает, что субстрат из среды потребляется, подчиняясь кинетике реакций первого порядка, и что скорость поглощения растет с увеличением концентрации субстрата до достижения максимальной (У . ). Это значение можно подсчитать, пользуясь уравнением Михаэлиса — Ментен и построив график зависимости скорости поглощения субстрата от его концентрации в коор- 260 динатах Лайнуивера — Берка. Нахождение скоростей активности микроорганизмов этим методом ограничено набором субстратов, используемым данным сообществом.
Обычно при определении гетеротрофного потенциала местообитания используют ацетат, глюкозу и другие углеводы, глутамат и другие аминокислоты или смесь меченых продуктов фотосинтеза, образуемых после инкубации водорослей на свету с нСО». При оценке метаболических активностей популяций определяют также процент дыхания, подсчитываемый как отношение суммы включенного '4С и выделившегося мСО» к выделившемуся мСО», выраженное в процентах. Процент дыхания — показатель количества энергии, затрачиваемой популяцией на поддержание устойчивости системы, причем чем выше процент дыхания, тем больше метаболической энергии тратится на поддержание жизнеспособности.
Измерение скорости микробной продукции обычно проводят с использованием меченого тритием тимидина Ц'Н]-Тд), который включается непосредственно в ДНК при биосинтезе и отражает скорость роста микроорганизмов в популяции или прироста биомассы. Поскольку !»Н)-Тд включается лишь в бактериальнуюДНК, этот метод оказался чрезвычайно удобным для анализа скоростей роста водных бактериальных популяций. Применение этого метода в почве связано с некоторыми экспериментальными трудностями. [»Н)-Тд сорбируется гуминовыми веществами, находящимися в почве в больших количествах, а также на минеральных веществах глинистых соединений и некоторых оксидов, а почвенную ДН К трудно экстрагировать. Скорос»ль фотосинтеза измеряют обычно в водных образцах в светлых и темных склянках с введенной порцией мСО».
Образцы инкубируют в течение нескольких часов или всего светового периода т з(уи и определяют скорость включения меченой углекислоты (обычно в течение первых ! — 2 ч инкубации), что отражает скорость фотосинтеза, и общее включенное количество "СО» (за более длительный период), что соответствует чистой продукции фотосинтеза (т.е. разнице между количеством включенного '4СО» и количеством органического вещества, минерализованного до мСО» в результате дыхания). Скорое»ль дыханин определяют, измеряя скорости выделения мСО» из органических субстратов, что отражает скорость минерализации органического вещества данной экологической ниши.
Существуют также методы нерадиоактивного определения метаболической активности, при которых измеряют скорость дыхания пробы, взятой из данного места, с помощью закрытого кислородного электрода типа Кларка или измерения образования СО, в постоянно аэрируемой пробе, куда внесен субстрат дыхания. Для длительных экспериментов по улавливанию образующейся СО, 26! разработаны герметичные колбы с двумя сообщающимися отсеками, в одном из которых происходит химическое потребление образуемой СО, концентрированным раствором щелочи, а в другую помешают исследуемый образец. Определение активности специфических ферментов также отражает метаболический потенциал микробной популяции данной экологической ниши. Одна часть таких активностей отражает энзиматический потенциал всего сообщества (активности суммарных дегидрогеназ, эстераз, фосфатаз), другая (целлюлазная, хитиназная, нитрогеназная, денитрифицирующая) — только специфической части сообщества, позволяя, однако, оценить тот или иной его потенциал.
Ферменты микроорганизмов, включенных в биогеохимический цикл элементов, важны для изучения микроб- ными экологами. Особенно важны ферменты, вовлеченные в цикл углерода и азота, так как они позволяют оценить устойчивость сообществ и экосистем и их потенциал в отношении минерализации органического вещества. При определении ферментативного потенциала популяций, наряду с перечисленным, измеряют активности липаз, целлюлаз, протеаз, амилаз. При измерении ферментативных активностей (н яш важно не нарушать микроокружение данной ниши и следить за температурой, рН, влажностью, Еп, а периоды инкубации (измерений) должны быть достаточно короткими, чтобы за это время количество микрорганизмов не могло значительно измениться.
Генетически модифицированные микроорганизмы (ГЕМОМ) и их интродукцив в природные ценозы Проблемы, возникающие при неконтролируемом внесении ГЕМОМ в окружающую среду, вызвали широкие дебаты в научном сообществе с привлечением правительственных структур и общественности. Периодически они возникают вновь после появления сообщений о каком-либо достижении генной инженерии или новых успехах в клонировании животных и человека.
Значительное место в этих спорах отводится ответу на вопрос: как долго ГЕМОМ и их ДНК будут существовать в окружающей природе и смогут ли модифицированные гены от ГЕМОМ быть переданы аборигенным микроорганизмам? Первоначальные эксперименты показали, что ГЕМОМ быстро отмирают при внесении в природные ценозы, поскольку не способны конкурировать с существующими сообществами микроорганизмов. Предполагалось, что чужеродная ДНК, внесенная в ГЕМОМ, снижает конкурентоспособность живых клеток по сравнению с неизмененными клетками 262 вследствие больших энергетических затрат на репликацию ДНК. Это предположение было подтверждено при изучении выживания в почве ГЕМОМ Рзеидотопаз зр.
с введенной плазмидой, несущей гены расщепления мощного гербицида, 2,4,5-трихлорфеноксиацетата. Клетки ГЕМОМ-псевдомонад быстро исчезали из почвенного образца и через несколько дней не обнаруживались при прямых высевах на среды. Однако спустя несколько недель ГЕМОМ-псевдомонады вновь можно было обнаружить в образце, что свидетельствует о том, что они полностью не вымирали. Результаты этих и последующих экспериментов показали, что модифицированные пссвдомонады могут жить в почве в течение длительного времени. Другие наблюдения доказали существование ГЕМОМ в почвенных и водных экосистемах в состоянии НФБ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
