А.И. Нетрусов, И.Б. Котова - Микробиология (1125593), страница 43
Текст из файла (страница 43)
3. В чем заключается явление диссоциации и какие свойства микроорганизма оно затрагивает? 4. Почему явление лиссоциации необходимо учитывать в природных местообитаниях и микробиологических производствах? 5. Каковы пути стабилизации синтеза биологически активных веществ при их промышленном получении? Глава 11 ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Методы исследования экологии микроорганизмов Выделение микроорганизмов нз экологических ннш н проблемы, связанные с некультнвируемымн формами.
По некоторым оценкам, исследователи могут культивировать меньше О,! % всего микробного разнообразия. Десятки тысяч видов микроорганизмов, живущих как симбионты животных и растений, нуждаются в выделении и идентификации. Хотя многие из таких микроорганизмов относят к так называемым «некультивируемым» и таким образом остающимся недоступными классическим микробиологическим методам идентификации, существует несколько способов, позволяющих оценить их разнообразие и распространение. Такие методы объединяют прямые микроскопические наблюдения и различные приемы на основе молекулярной диагностики, включая амплификацию диагностируюших последовательностей генома, кодирующих синтез молекулы !6Б рРНК для последующей их расшифровки.
Методы прямого прижизненного окративания различных проб воды, почвы и осадков позволяют выделять гораздо больше живых клеток, чем высевы на различные среды. Большое расхождение в результатах прямого счета в сравнении с высевом на среды поставило вопрос: прижизненно окрашенные микроорганизмы являются живыми или мертвыми? Применение в качестве прижизненного красителя акридинового оранжевого показало, что часть клеток окрашивается с последующей зеленой флуоресценцией, часть — остается оранжевой.
Это привело вначале к неверному выводу о том, что зеленые клетки — живые, а оранжевые— мертвые. Впоследствии было выяснено, что цвет флуоресценции зависит от отношения ДН К/белок в клетке, в результате активно делящиеся клетки выглядят зелеными, а растущие более медленно или покоящиеся клетки дают оранжевую флуоресценцию, оставаясь при этом живыми. В дальнейшем были разработаны прямые методы опенки метаболитической активности клеток (клеточное дыхание), позволяющие отличить живые клетки от неживых в природных пробах. 245 Методы основаны на применении различных солей тетразолия, которые при восстановлении в клетке дегидрогеназами (дыхательная активность) превращаются в нерастворимый формазан красного цвета, что можно обнаружить визуально под микроскопом.
Имеется способ различать живые, мертвые и поврежденные клетки при измерении состояния мембранного потенциала с помощью флуорохромов. Другой способ предлагает добавлять к пробам живых клеток ингибитор клеточного деления (налидиксовую кислоту), при этом активно растущие клетки будут удлиняться без вступления в фазу бинарного деления. Возможно, что многие микроорганизмы, наблюдаемые при прямом микроскопировании как живые, вступили в состояние «некультивируемая форма бактерий (НФБ)». Эта концепция была предложена американским микробиологом профессором Р. Колвелл в ! 987 г.
Показано, что часть клеток из природных образцов не дает колоний на лабораторных средах, хотя в природе они ведут активный образ жизни и патогенные формы сохраняют свою вирулентность по отношению к животным. Эксперименты четко показали, что такие патогены человека, как Ее8(опеИа рпеиторлИи, За(топеИа епгепуй(и, У~Ьпо ело!егае и К иг(п$киз, постоянно образуют НФБ в природных эконишах. Таким образом становится понятной важность прямых микроскопических наблюдений природных образцов для обнаружения НФБ патогенов. Для наблюдения за некультивируемыми формами микроорганизмов в природных образцах применяют методы молекулярного анализа. Разработано несколько десятков диагностических проб- последовательностей ДНК/РНК для специфического обнаружения определенных видов, родов, семейств или таксонов более высокого порядка непосредственно в природных образцах.
С использованием таких последовательностей было обнаружено, что морские воды содержат многие виды архей и бактерий, которые не поддаются культивированию в лаборатории. Олигонуклеотидные пробы длиной (8 — 20 нуклеотидов являются наиболее подходящими для такой диагностики, так как легко гибридизуются со специфическим участком ДНК искомого организма. Даже небольшие количества некультивируемых форм могут быть обнаружены в популяциях природных образцов с помощью П((Р-амплификации диагностических последовательностей ДНК.
Жизнеспособные клетки микроорганизмов можно идентифицировать также с помощью специфических иРНК методом обратной транскрипции, но при использовании этого метода следует помнить о том, что время полужизни некоторых бактериальных иРНК может составлять меньше минуты.
246 Изучение активности микроорганизмов в природе Миквоэлектроды. Поскольку микробы очень малы, также малы и их микроокружения. Для клетки размером 3 мкм микроокружение на расстоянии 3 мм соответствует расстоянию в 2 км для человека! Экспериментаторы разработали специальные миниатюрные электроды диаметром до 2 — 3 мкм, которые позволяют проникать в микроокружение клеток в природных эконишах и проводить там измерения градиентов рН, ЕЬ, солености, температуры, содержания кислорода или некоторых химических элементов (1Ча', К', Нб, ХН;, )Ч20 и т.д.). Разработаны также миниатюрные спектрорадиометры, позволяющие качественно измерять поглощение света в микронишах, что важно при изучении структуры и функционирования пиано-бактериальных матов и других микробных сообществ.
Микроэлектроды интенсивно применяют при изучении циано-бактериальных сообществ, на поверхности которых развиваются цианобактерии и водоросли, являющиеся основными продуцентами мата, до глубины, на которой свет становится лимитирующим фактором. Прослежено, что на глубине 1,0 — 1,2 мм такого мата (при его обшей толщине около 2 см) оксигенный фотосинтез прекращается (и сообщество становится анаэробным). С этого уровня резко возрастает концентрация сероводорода, возникающего в результате активности сульфатредукторов нижних слоев мата (в данном примере рассмотрена структура матов морских местобитаний). Концентрация сероводорода в каждом слое сообщества — результат сбалансированного процесса его выделения сульфатредукторами и его потребления аноксигенными фототрофами и тионовыми или бесцветными серными бактериями.
Радиоизотопы. Методы измерения активности микроорганизмов в их природных местообитаниях или свежих образцах с применением радиоизотопов являются наиболее чувствительными из всех существующих. Эти методы могут пролить свет на судьбу того или иного субстрата в микробных сообществах определенной экониши. Для измерения интенсивности фотосинтеза применяют метод измерения включения меченого мСОь имея контролем при этом «темновую» пробу. Для обнаружения и измерения скорости сульфатредукции применяют изотоп серы, 'ЪО4~, который превращается в Н,"Б. Скорость метаногенеза можно проследить по превращению '4СО2 в '4СН4 в присутствии значительного количества водорода или по трансформации '4С-метанола, метилированных аминов или ацетата в мСН4.
Хемоорганотрофные активности измеряют по скорости включения меченых по '4С органических соединений, обычно для этих целей используют глюкозу или аминокислоты. Эффект использования органики можно определять и 247 по выделению '«СО, из меченых по '«С органических субстратов. Во всех случаях, определяя скорости процессов потребления изотопа или его выделения, необходимо учитывать соотношение меченого и немеченого субстрата, внесенного в пробу для расчета специфической активности потребления субстрата или образования продукта. Эксперименты с радиоактивными изотопами широко применяют в микробной экологии, однако, поскольку в гетерогенных природных местообитаниях всегда могут проходить и химические превращения субстратов, необходимо параллельно проводить опыты с соответствующими контрольными образцами, ключевыми из которых являются пробы с убитыми клетками. Для этой цели часто применяют формальдегид в концентрации 4% или кипячение пробы.
Стабильные изотопы. Поскольку большинство биогенных элементов имеет изотопы, как стабильные, так и радиоактивные, можно изучить активность микроорганизмов в природных образцах с применением так называемого «изотопного эффекта», суть которого сводится к тому, что живые клетки способны дифференцированно использовать легкие и тяжелые изотопы одного и того же элемента в биологических трансформациях. В микробной экологии наибольшее распространение получили исследования, связанные с трансформацией изотопов углерода и серы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
