А.И. Нетрусов, И.Б. Котова - Микробиология (1125593), страница 46
Текст из файла (страница 46)
Методы основаны на экстракции из почвенных, осадочных или водных образцов тотальной ДНК, ее очистки и анализа с помощью градиентных гель-электрофорезов — термического и денатурируюшего (ТОО Е/ООО Е). Основной трудностью при экстракции тотальной ДНК является ее отделение и очистка от гуминовых веществ почвы. Однако методы, позволяющие проводить такую очистку, постоянно совершенствуются.
После экстракции ДНК подвергают иммобилизации на нитроцеллюлозном или нейлоновом фильтре, расплавлению и гибридизации с известными последовательностями генов, ответственными за синтез тех или иных специфических ферментов. Так, наличие в пробе тотальной ДНК генов, гибридизуемых с геном, кодирующим нитрогеназу, указывает на присутствие в анализируемом сообществе азотфиксаторов, генов метанмонооксигеназы— метанотрофов, генов РуБисКΠ— автотрофных микроорганизмов, фиксирующих углекислоту через цикл Кальвина. Расшифровано уже несколько десятков генов, кодирующих ключевые реакции тех или иных процессов, и, применяя метод гибридизации, можно делать выводы о наличии определенных микроорганизмов в анализируемой пробе.
Метод ПЦР позволяет идентифицировать неизвестные микроорганизмы, находящиеся в природной пробе, без выделения чистых культур. Разработаны «универсальные» праймеры на бактерии, археи и эукариоты, которые дают возможность специфически амплифицировать последовательности этих трех групп микроорганизмов, разделить их с помощью ТООЕ/ОООЕ-методов и затем, после вторичной амплификации отдельных полос, получить почти полный профиль микробного сообщества с идентификацией отдельных филогенетических линий и классификацией микроорганизмов на основе последовательностей (6$ рРНК. Для идентификации нужных микроорганизмов в сообществе используют гены-репортеры, которые легко обнаружить после проведения химических реакций (1асУ-ген, кодирующий ~5-галактозидазу, и ху!Е-ген, кодирующий синтез ферментов метаболиз- 256 ма толуола) или после экспрессии в клетке испусканием света различной длины волны (!их-гены или ОРР-гены, кодирующие синтез зеленого флуоресцирующего белка).
Гены-репортеры используют обычно для обнаружения тех или иных активностей в природных образцах при определении выживаемости введенных в образец микроорганизмов, для обнаружения экспрессии и изучения активности нужного гена/фермента, под контролем промотора которого экспрессируется и ген-репортер. Генетическая конструкция в таком случае выглядит и работает следующим образом.
Если нужный ген экспрессируется и фермент осуществляет свою функцию (например, расщепляет тот или иной ксенобиотик), то по люминесценции гена-репортера об этом можно сулить на удалении (например, в толще почвы свет от места реакции трансмиттируется в таком случае с использованием оптоволоконных световодов). По тушению люминесценции в генно-инженерных щтаммах Есол судят о степени токсичности пробы воды или почвы.
Определение численности микроорганизмов При работе с чистыми культурами определение количества микроорганизмов не вызывает сложностей. Другое дело, когда надо определить число микроорганизмов в природных образцах, поскольку микроорганизмы в них чрезвычайно разнообразны. Методы, применяемые для подсчета вирусов, бактерий, грибов, водорослей и простейших, различны. Специальную технику применяют для подсчета психрофилов и строго анаэробных форм.
Существует лва метода подсчета микроорганизмов: () прямой счет клеток под микроскопом и 2) непрямой подсчет после подращивания на твердых средах (учет живых клеток). Чаше используют первый метод, при этом обычно не различая живые и мертвые клетки (по Виноградскому). Метод можно модифицировать с применением эпифлуоресцентного микроскопа и флуоресцируюших дифференциальных красителей для подсчета живых и мертвых клеток в препарате. Клетки микроорганизмов можно подсчитывать также в определенном объеме жидкой пробы под световым микроскопом (камеры Тома — Горяева, Петрова — Хаузера).
Иногда для определения скорости роста клеток применяют метод подсчета делящихся клеток, причем было показано, что этот метод коррелирует со скоростью синтеза РНК, измеренной по включению меченого аденина. Число специфических клеток микроорганизмов в природных образцах может быть установлено с помощью применения техники флуоресцирующих антител. Но для этого необходима предварительная подготовка, включающая выделение чистых культур ис- 257 комых видов и наработку специфических антител к таким клеткам.
Этот метод позволяет следить за развитием индивидуальных микроорганизмов в их естественных местах обитания (аутоэкология). Антитела являются чрезвычайно специфичными по отношению к выбранному виду, что в целом делает этот метод поразительно точным инструментом исследования. Модификациями метода являются применение специфичных флуоресцируюших антител, выработанных по отношению к определенным ферментам, а также использование флуоресцируюших генетических проб (генных зондов), позволяющих идентифицировать микроорганизмы с одинаковыми генами в популяции. В одной и той же популяции можно обнаружить различные гены, имея генетические зонды, флуоресцирующие разным цветом. При учете живых микроорганизмов после подращивания применяют в основном два метода: 1) подсчет на чашках выросших колоний после соответствующих разведений и 2) учет по методу предельных разведений.
Оба метода требуют разделения микроорганизмов перед посевом на индивидуальные клетки, которые затем дают потомство. Применение методов полсчета с посевами требует бережного обращения с пробами для сохранения жизнеспособных клеток. Следует учитывать, что для подсчета микроорганизмов различных групп необходимо применять разные среды, которых разработано более тысячи для выявления бактерий, архей, грибов, водорослей, простейших, как аэробов, так и анаэробов.
Для выявления отдельных групп микроорганизмов применяют селективные и диагностические среды, среды с антибиотиками, специфически подавляющими развитие отдельных групп микробов. Модификацией метода служит гибридизация колоний, при которой из тысяч колоний, выросших на чашке, можно выявить одну, специфически гибридизирующуюся с выбранным геном- маркером. Метод позволяет подсчитать число микроорганизмов нужного вида или с необходимой функцией (в зависимости от примененного гена для гибридизации) среди большого количества сопутствующей микробиоты из природных проб.
Определение микробной биомассы Измерение биомассы применяют для подсчета урожая микроорганизмов, понимая под биомассой сухую массу живого материала, выраженную в единицах массы (г/л). Измерение биомассы природных проб часто не приводит к точным результатам вследствие большого количества побочных эффектов, связанных с отбором проб и их измерением. Поэтому наиболее приемлемыми методами 258 определения биомассы в природных образцах являются методы, связанные с определением биохимических параметров клеток.
Для таких измерений предполагают, что количество измеряемого компонента клеток одинаково для всех видов клеток, что, конечно же, идеализировано. Поэтому измерения биохимических параметров биомассы необходимо экстраполировать с осторожностью. Наиболее популярным методом измерения биомассы является измерение содержании АТФ и общего содержания адениновых нуклеотидов с последующим пересчетом на содержание углерода клетки или массы сухого вещества. Метод позволяет быстро и точно (с люциферин/люциферазной пробой) измерить содержание АТФ в образце, причем количество АТФ строго соответствует биомассе живых клеток, так как после отмирания клетки пул АТФ в ней резко снижается или исчезает вовсе.
Общий пул аденилатов (А, = = АТФ + АДФ + АМФ) не зависит от метаболического состояния клетки и более полно соответствует содержанию биомассы в анализируемой пробе. Другим методом является измерение содержания «омионентое клеточных стенок (например, ацетилмурамовой кислоты (МК) или липополисахаридов). При оценке содержания мурамовой кислоты ее гидролизуют для высвобождения лактата, который определяют энзиматически. Установлено, что все грамположительные бактерии содержат 44 мкг М К/мг С клетки, тогда как для грамотрицательных клеток это соотношение равно 12 мкг/мг.
Для оценки содержания грибной биомассы используют определение концентрации хитина, но на точность метода влияет количество почвенных членистоногих и насекомых. При отсутствии в пробе растений можно определять биомассу фототрофных водорослей и бактерий, измеряя количество хяоро- 4)ияяа. По концентрации хлорофилла а судят о содержании биомассы водорослей и цианобактерий после экстракции пробы хлороформ/метанольной смесью с последующим измерением поглощения при 665 нм. Поглощение того же экстракта, измеренное при 850 нм, будет отражать количество всех бактериохлорофиллов, таким образом оценивают количество пурпурных фототрофных бактерий.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
