А.И. Нетрусов, И.Б. Котова - Микробиология (1125593), страница 45
Текст из файла (страница 45)
Некоторые приборы (аппарат Кротова) сконструированы таким образом, что они направляют поток засасываемого воздуха при отборе пробы на поверхность открытой чашки Петри с агаризованной средой, на которой, как считают, осаждаются все частицы, взвешенные в воздухе, включая микроорганизмы. Пробы бяоаогячеекик образцов растений или животных включают сбор биологических жидкостей (растительный сок, кровь, моча, лимфа, мокрота), выделений (каловые массы) или проб с поверхности объекта, а также внутренних органов (биопсии).
С поверхностей микроорганизмы смывают или счищают стерильным буферным раствором или физраствором (0,85%-й раствор ХаС! в дистиллированной воде) с помощью стерильных ватных тампонов. В других случаях микроорганизмы сохраняют непосредственно в образцах тканей, что важно для наблюдения их топографического распределения в тканях или количественного учета. Иногда анализы образцов проводят непосредственно под микроскопом (сканирующая электронная микроскопия) для рассмотрения взаимодействия микробных сообществ или изучения ассоциаций между животными, растениями и микробиотой. 252 Обработка проб Пробы, содержащие микроорганизмы, очень редко содержат такое их количество, которое можно учесть, не прибегая к концентрированию или разбавлению образца.
Концентрированные образцы должны быть разбавлены до нужной плотности микроорганизмов с последующим высевом на питательные среды (подсчет живых клеток). Разведение проб осуществляют обычно в 10-кратных последовательностях с тем, чтобы на поверхность среды в чашке Петри попало 50 — 200 клеток, образующих колонии. При этом важно подобрать разбавитель, так как показано, что концентрация живых клеток может увеличиваться почти в два раза при высеве почвенных микроорганизмов из одной и той же пробы, если использовать разные солевые растворы лля разведений.
Разбавленные образцы должны быть сконцентрированы перед посевом. Для этого применяют центрифугирование или фильтрование через мембранные фильтры с заданным размером пор. Если важно определить число живых микроорганизмов в пробе на момент ее отбора, необходимо учитывать возможность размножения клеток в образце во время хранения или транспортировки (феномен, известный как эффект бутылки» и особенно важный для обработки проб морской воды, лишенных природных абсорбирующих поверхностей). Когда пробу морской воды помещают в стерильную посуду, питательные вещества воды сорбируются на внутренней поверхности сосуда, повышая локальную концентрацию субстратов, что становится притягательным для микроорганизмов, которые также сорбируются на стенках и вследствие повышенной концентрации субстратов, начинают быстро размножаться.
С другой стороны, условия хранения собранных образцов могут привести к гибели части популяции микроорганизмов, что вызовет занижение общего микробного числа. При разбавлении образцов микроорганизмы должны быть распределены в объеме пробы равномерно. Это сложная задача, особенно при обработке проб почвы или осадков, в которых микроорганизмы имеют тенденцию прикрепляться к частицам, органическим или минеральным. Степень десорбции клеток с частиц в значительной степени зависит от концентрации суспендирующего раствора и его химического состава, времени, температуры и силы перемешивания. Процесс оптимальной десорбции клеток с частиц сильно зависит от состава образца и поэтому требует абсолютной стандартизации методик подготовки проб к посевам.
При концентрировании образцов важное место отводят выбору фильтра, так как фильтры с малыми порами быстро забиваются и не позволяют фильтровать пробы достаточных объемов, а фильтры с большими порами могут пропустить часть кпеток. Поликарбонатным фильтрам отдают предпочтение над нитроцеллю- 253 лозными в силу более плоской поверхности и более унифицированных размеров пор. Химический состав материала фильтра влияет также на выживаемость микроорганизмов.
Несоблюдение при обработке проб условий, требуемых для той или иной физиологической группы микроорганизмов, может существенно изменить результат анализа. Так, обработка проб для выявления строгих анаэробов требует проведения всех разведений в растворах без кислорода и посева проб в бескислородной атмосфере. Для выявления психрофильных микроорганизмов вся стеклянная посуда и жидкости, соприкасающиеся с пробой, должны быть охлаждены для максимального сохранения жизнеспособных клеток психрофилов.
Если пробы не предназначены для определения числа живых и мертвых клеток, то их обычно фиксируют с помощью формальдегида или глутарового альдегида непосредственно после отбора. Такие препараты сразу готовы для прямого микроскопирования. При сборе вирусных частиц из природных проб необходимо применять специальные методы их концентрирования.
Вирусы можно сконцентрировать из водных образцов при неоднократной адсорбции/элюции подкисленных проб при пропускании их через эпоксидные, фиберглассовые или нитроцеллюлозные фильтры. Сорбированные частицы затем элюируют щелочными растворами. Процедуру можно неоднократно повторять, тысячекратно концентрируя вирусные частицы, например из морской воды или проб осадков. Фенотипическое обнаружение микроорганизмов При чашечном методе посева природных образцов можно достичь двух результатов: получить отдельные колонии чистых культур микроорганизмов (клонов одной клетки) и начать фенотипическое определение различных организмов (описание колоний). В некоторых случаях клетки из отдельно взятой колонии могут быть введены в пластинки для анализа (АР!-тест, В(о!оя), по результатам которого возможно определение микроорганизма до рода.
Вьщеление и идентификация членов микробного сообщества с использованием метода прямого рассева на чашки эффективно при высокой концентрации клеток того или иного члена сообщества. Если же относительное количество клеток искомого вида невелико, они могут «потеряться» при таком методе обработки пробы, и в этом случае метод прямого рассева на чашки с разведениями пробы непригоден для анализа. Поскольку разные члены идентифицируемого микробного сообщества могут предьявлять различные требования к компонен- 254 там среды (состав и содержание солей, органического субстрата), а также к физическим условиям выращивания (температура, влажность, содержание кислорода и т.д.), для более полного выявления членов сообщества применяют параллельные посевы на среды различного состава (например, для выявления копиотрофов и олиготрофов, органотрофов и литотрофов, азотфиксаторов, бродильшиков и т.д.).
Существуют приемы добавления в среды специфических ингибиторов для подавления развития той или иной группы микроорганизмов (например, актидион подавляет развитие эукариот на чашке с прокариотами). Обнаружение микроорганизмов химическими методами Анализ микрооргаиизмов яо их лияидиому составу. Липиды— обязательные компоненты мембран, окружающих цитоплазму каждой микробной клетки. Липидный состав различных микроорганизмов в значительной степени отличается друг от друга.
Существуют шесть (или даже больше) классов липидов, обнаруженных у микроорганизмов, каждый из которых состоит из индивидуальных липидов с шестью или более структурными особенностями. Каждый микроорганизм имеет свой липидный профиль (основной липид), и это свойство было положено в основу химической идентификации микроорганизмов, основанной на составе и содержании липидов в клетке. Следует отметить, что данный метод не идеален, поскольку любые микроорганизмы могут существенно менять профиль липидов в зависимости от возраста культуры и условий культивирования клеток. Анализ, основанный на изучении и сравнении метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК), входящих в состав липидов, получил широкое распространение вследствие его простоты и доступности.
Полный процесс идентификации включает эстерификацию липидов, метилирование входящих в их состав жирных кислот, их разделение на хроматографических колонках и количественное определение с помощью газовой хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Специальным образом обработанные колонки дают хорошее разрешение МЭЖК, что позволяет сравнивать их время удерживания с ранее идентифицированными липидными профилями (стандарты). Количество каждой жирной кислоты может быть рассчитано по площади хроматографического пика, а абсолютные концентрации определяют, вводя внутренний стандарт.
Анализ МЭЖК, экстрагированных из почвенных образцов, позволяет быстро и относительно недорого идентифицировать состав популяции почвенных микроорганизмов. Интерпретация 255 результатов в некоторых случаях затруднена из-за идентичности многих липидов у различных представителей изучаемого микробного сообщества. Обнаружение отдельных генов и геномных последовательностей С обнаружением отлельных генов или специфических геномных последовательностей связаны прежде всего возможности анализа микробных сообществ без выделения и идентификации отдельных его членов в чистых культурах.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
