А.И. Нетрусов, И.Б. Котова - Микробиология (1125593), страница 44
Текст из файла (страница 44)
Углерод в природе представлен в основном в виде изотопа цС, хотя встречается и в виде стабильного тяжелого "С, а также радиоактивного '«С. Подобно этому, большинство соединений серы состоит в основном из зЪ, хотя встречается стабильный мб и радиоактивный зЪ изотопы. Большинство биохимических реакций, проводимых живыми клетками, способно выбирать соединения с более легким изотопом из имеющихся в наличии. Поэтому соединения с более тяжелыми изотопами остаются непрореагировавшими и их относительная доля в оставшемся субстрате увеличивается, а в продукте — уменьшается.
Этот феномен получил название «фракционирование изотопов» При изучении проб различного происхождения оказалось, что наиболее «тяжелыми» по углероду являются морские карбонаты химического происхождения с соотношением ЛпС =+5%«. Недавние (геологически) морские осадки имеют Ь"С = -(0... 35 %«, что указывает на участие микроорганизмов в их формировании, биомасса растений имеет дефицит по "С 12...25%», нефть— 20...35%», метан — 25...80%»! Интересно отметить, что скальные породы возраста около 3,5 млрд лет (время появления жизни на Земле) обеднены по пС на ! 2 — 22%«, что свидетельствует об очень раннем возникновении автотрофии на планете.
Подобные измерения, проведенные в отношении изотопов серы, показали, что у метеоритного сульфида Лззб = -3 — +3%«, 248 у залежей элементарной серы — -!8...+!В%о, а сульфид морских осадков может иметь дз'Ь до -30%о, что указывает на значительный вклад сульфатредукторов в процесс глобального цикла серы. Для понимания структуры и функционирования экосистем мало знания о взаимоотношениях микробных сообществ, необходимы также количественные данные о числе микробов того или иного сообщества, биомассы популяций, скоростей биологических активностей, деления клеток и их отмирания, а также скоростей оборота возникающих циклов материи через экосистему.
Количество, биомасса и активность — это вполне определенные экологические параметры, которые, хотя и коррелируют между собой, не должны рассматриваться как взаимозаменяемые. Обычно природа решаемой экологической проблемы сама диктует, какой из этих параметров следует измерять, а технические трудности заставляют исследователя измерять число клеток и затем высчитывать более относительный параметр — биомассу. После сделанных подсчетов необходимо с критичностью отнестись к полученным результатам, рассуждая о приемлемости выводов при всех условиях эксперимента.
Методы, используемые при таких измерениях, являются основанием для определения микробной экологии как научной дисциплины и общего понимания экологии микробов. Применение количественного подхода более чем что-либо вьшеляет экологов среди натуралистов. Сбор образцов Для исследования числа и активности микробных популяций в различных экосистемах разработаны многочисленные методологические подходы.
При изучении микроорганизмов в природных образцах (общее число, число сообществ, их метаболические активности) репрезентативные части образца анализируют и результаты проецируют на сообщество в целом или экосистему. Термин «репрезентативный» означает, что проба должна отражать разнообразие и плотность организмов общего местообитания, из которого взята проба. Во многих местообитаниях распределение микроорганизмов не гомогенное, а скорее кластерное.
Поэтому любая взятая проба, несомненно, точечная по отношению к изучаемому местообитанию — пространству, может содержать много и мало микроорганизмов, что приведет к неверной экстраполяции результатов. Это особенно верно для микроорганизмов, которые живут в условиях микроокружения, о чем экспериментатор может во время отбора пробы и не догадываться. Обработка сложных проб, приготовленных из собранных индивидуальных проб с использованием специальных смесителей, может минимизировать ошибку.
Уровень достоверности при экстраполяции данных соот- 249 ветствующих проб на всю эконишу должен быть подкреплен статистическим анализом. Важно помнить, что каждое измерение состоит из трех фаз: 1) сбор образцов; 2) подготовка проб; 3) собственно измерение. При интерпретации результатов должны быть критически рассмотрены все три стадии обработки проб. При отборе проб из таких сложных и разнообразных местообитаний, как кишечник животных, поверхностный слой почвы, воды озер, глубоководные осадки морей, применяют различные подходы.
Невозможность вплотную приблизиться к месту отбора проб заставляет придумывать различные пробоотборники для дистанционного забора проб. Методы отбора проб и их хранение не должны изменять количества клеток или их активности в ббльшую или меньшую сторону.
Исследователь должен быть уверен. что отобранные образцы являются репрезентативными и не загрязнены посторонними микроорганизмами, поэтому способ отбора пробы должен гарантировать наличие в пробе лишь микроорганизмов нз нужного местообитанияя. Пробы почвы отбирают обычно с соблюдением минимума асептики, так как количество микроорганизмов в поверхностных почвенных горизонтах во много раз больше, чем в воздухе или не- стерильном (но чистом!) контейнере для образца. Для сбора образцов со значительной глубины отбирают керн, который высверливают вручную или с помощью специальных механизмов, и внутри керна находят нужные зоны, уже работая асептически в лаборатории.
Для отбора проб почвенных микроорганизмов, находящихся в относительно небольшом количестве, применяют «атграктанты» или «наживки». В некоторых случаях в почву опускают чистые стекла или стекла со специфической агаризованной средой, на которой развиваются нужные микроорганизмы (стекла обрастания по Холодному). Чистые стекла, не обладающие селективными свойствами, используют для подсчета прикрепнвшихся микроорганизмов в почвах или осадках.
В этом случае стекло служит аналогом минеральных частиц почвы (кварц) и отражает микробное разнообразие неселективно. Еще одним вариантом стекол обрастания является плоскопараллельные капилляры, впервые разработанные Перфильевым. Их также называют педоскопы при погружении в почву и пелосколы — при погружении в донные осадки. Капилляры открыты с обоих концов, и микроорганизмы могут свободно перемещаться внутри них. Часто капилляры заливают средой (аттрактант), селективной для той или иной физиологической группы микроорганизмов.
Преимущество плоских капилляров в том, что их содержимое можно рассматривать под микроскопом непосредственно, а плоская стенка сводит к минимуму искажение и преломле- 250 ние света при прохождении через капилляр. Применение капилляров Перфильева позволяет проводить прижизненные наблюдения за развитием почвенной или осадочной микробиоты, дает возможность вести непрерывные (с помощью автоматической кинокамеры, рассчитанной на определенное количество снимков в час или день) исследования развития микробных популяций, не опасаясь подсыхания препарата, расширяет поле деятельности экспериментатора с внесением разного рода питательных веществ с одного конца капилляра, делая таким образом его проточным.
Такие капилляры позволяют следить за развитием анаэробного сообщества без применения сложной техники анаэробного культивирования. Капилляры помогают наблюдать за прижизненным развитием экосистем в природных условиях, не нарушая их целостности, и дают возможность обнаруживать необычные морфологические формы пока некультивируемых микроорганизмовв. Различные методы разработаны для отбора проб воды. Проблем с отбором водных образцов обычно бывает больше, чем с почвенными пробами, поскольку практически всегда пробы воды отбирают на значительном удалении от экспериментатора. При этом возникают проблемы в соблюдении стерильности, поскольку открытые водные пространства содержат немного микроорганизмов, и эти пробы легко загрязнить неестественной микробиотой самого прибора для отбора проб.
Каждый из разработанных пробоотборников имеет свои преимушества и недостатки. Целью создания часто довольно сложных приспособлений является уверенность, что проба воды действительно отобрана из нужного места, например с глубины 100 м. Среди разработанных образцов водных пробоотборников можно отметить следующие: ° вакуумированные бутыли, которые заполняются водой на определенной глубине с помощью грузика-мессенджера, разбивающего водозасасывающий капилляр; ° стерильный пластиковый пакет, раскрывающийся с помощью пружины на определенной глубине после опускания груза с поверхности, одновременно приводящего в движение пружину и бритву, вскрывающую отверстие в пакете; ° пробоотборник с укрепленными на разной глубине стерильными шприцами, в которые одновременно засасываются пробы воды.
Такие приспособления применяют обычно для отбора проб из неглубоких стратифицированных озер. С глубоководными пробами необходимо предусматривать возможность декомпрессии организмов при подъеме на поверхность. Разработанные пробоотборники позволяют открывать и закрывать входные отверстия на глубине, не позволяя давлению внутри пробы падать при подъеме.
251 Пробы осадков обычно отбирают с поверхности с помощью скребков или ковшей, однако такие способы не позволяют уберечь данные пробы от загрязнения посторонней микробиотой. С соблюдением асептики можно отбирать пробы-керим, которые затем в лаборатории в стерильных условиях делят в вертикальном направлении, что позволяет прослеживать динамику осадков по горизонтали. Наиболее точно отбирают пробы морских осадков с использованием миниатюрных двух-трехместных подводных лодок, которые погружаются на глубину до 3 км, где с помощью манипуляторов и специальных сверл отбирают пробы осадков в точно локализованном участке (особенно это важно в местах подводных термальных источников или «черных курильщиков»).
Использование мини-подлодок позволяет также отбирать пробы, обрабатывать их нужным образом на месте отбора (например, вводить радиоизотопы) и оставлять на месте для инкубации с последующим подъемом на поверхность для анализов. Отбор проб еоздула необходимо проводить с применением аппаратов, которые минимально травмируют живые клетки микроорганизмов, находящиеся обычно в мельчайших капельках аэрозолей. Пассивная седиментация, позволяющая подсчитать количество осевших (и образовавших колонии) клеток микроорганизмов на поверхности открытых чашек Петри с агаризованной средой, пригодна для подсчета количества спор грибов, но не для количественного учета находящихся в воздухе бактерий. Чаще всего пробы воздуха отбирают, пропуская определенный его объем через бактериальные фильтры, размер пор которых можно варьировать для дифференциации микроорганизмов воздуха по размеру.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
