М.В. Медведева, Н.Б. Гусев - Определение концентрации белка в растворе (1123317), страница 7
Текст из файла (страница 7)
(2009) Основы практической биохимиибелка. Учебно-методическое пособие, МАКС Пресс, Москва, с. 19-20.2. Schaffner W., Weissmann С. (1973) A rapid, sensitive, and specific methodfor the determination of protein in dilute solution. Anal. Biochem., 56, pp.502-514.3. http://en.wikipedia.org4. Флуоресцентные методы определения концентрации белкаВ ряде случаев, когда применение спектрофотометрических иколориметрических методов невозможно или неудобно (мешают примесиразличных соединений, низкая молекулярная масса белка, белки не содержатароматических аминокислот и не поглощают при длине волны 280 нм, и т.п.),можно воспользоваться флуоресцентными методами.
Эти методы, какправило, высокочувствительны и основаны на том, что при взаимодействииряда веществ с белками образуются флуоресцирующие продукты. При этомспектры флуоресценции исходных соединений и образовавшегося в ходереакции комплекса существенно различаются.Разработаны и широко применяются несколько флуоресцентныхметодов количественного определения концентрации белка, среди которыхнаиболее востребованными являются методики с использованиемфлуорескамина и о-фталевого диальдегида.334.1.
Определение концентрации белка с флуорескаминомр и н ц и п м е т о д а . Флуорескамин (4-фенил-спиро[фуран-2(ЗН), Г-фталан]3,3 ’-дион; флурам) - соединение, взаимодействующее с первичнымиаминами. При взаимодействии флуорескамина с белком (он связывается сконцевыми аминогруппами и е-ЫНг-группами лизина) в водной средеобразуется флуоресцирующий продукт (рис. 12), который в щелочной средеимеет два максимума оптического поглощения (при 300 и 390 нм) имаксимум флуоресценции (при 480 нм) (рис. 13).
При этом ни самфлуорескамин, ни продукты его распада в растворе не флуоресцируют.Следовательно, при окрашивании белков и пептидов флуорескамином несоздается флуоресцирующий фон и окрашенный продукт можно не отделятьот красителя, что очень удобно. Интенсивность флуоресценции возрастает сувеличением концентрации белка (рис. 13).ПФлуорескаминФлуорофорРис. 12. Образование флуоресцирующего продукта при взаимодействиипервичного амина с флуорескамином. (http://www.biotek.com).•О©£50ваааг*ага;81•©araj£asSoSsj fai5350400450500550Д ли н а волны, нмРис.
13. Спектры возбуждения (Ех) и флуоресценции (Em) флуорескамина вотсутствие БСА (а) и в присутствии различный концентраций БСА: (Ь) 5мкг/мл; (с) 10 мкг/мл. (http://www.sciencedirect.com).34Реактивы:1. Натрий-боратный буфер - 40 мМ, pH 9,0-9,1, содержащий 1%-ныйдсн2. Раствор флуорескамина: - 0,3 мг/мл. 4,5 мг флуорескамина растворяютв 15 мл ацетона или диметилсульфоксида (ДМСО) (флуорескаминплохо растворяется в воде и в водной среде крайне нестабилен).3.
Раствор лизина и/или аланина: - -400 мкМ. Раствор(ы) используют дляпостроения калибровочного(ых) графика(ов) по NH2-rpynnaM.4. Стандартный раствор белка (с известным количеством свободных NH2групп), например, БСА с концентрацией 1 мг/мл для построениякалибровочного графика. Точную концентрацию БСА определяютспектрофотометрически, считая коэффициент удельного поглощенияпри 280 нм равным 0,646 мл/см*мг (см. выше). Количество свободныхаминогрупп определяют из аминокислотного состава белка (базаданных UniProt (Swiss-Prot).5.
Исследуемый раствор белка.Ход работы:В пробирки Эппендорф 1,5 мл вносят 0-50 мкл растворов аминокислот(0-20 нмоль лизина или 0-40 нмоль аланина) или стандартного белка (егоколичество зависит от количества е-аминогрупп лизина) и исследуемогобелка. В пробы добавляют воду до конечного объёма 50 мкл и 750 мклборатного буфера, пробы тщательно перемешивают. Непосредственно передизмерением во все пробы добавляют 200 мкл раствора флуорескамина ивновь тщательно перемешивают. Флуоресценцию возбуждают светом сдлиной волны 390 нм (^еХ=390 нм) и измеряют при длине волны 480 нм (Кст=480 нм).Перед тем как проводить измерения, следует убедиться, что максимумфлуоресценции действительно равен 480 нм, так как в зависимости отприбора, он может незначительно изменяться. С этой целью нужно записатьспектр флуоресценции комплекса аминокислоты с флуорескамином,возбуждая флуоресценцию при 390 нм и регистрируя ее в интервале длинволн от 420 до 520 нм, и выбрать ту длину волны, при которойфлуоресценция пробы максимальна.При измерении флуоресценции с флуорескамином, используя вкачестве стандартов аминокислоты или другой белок, фактически можноопределить количество и, соответственно, концентрацию аминогрупп.
Знаяколичествоаминогруппвисследуемомбелке (исходяизегоаминокислотного состава), можно легко рассчитать концентрацию этогобелка. Задача еще упроститься, если в качестве белка-стандарта использоватьтакой же, как и исследуемый белок, с известной концентрацией. Для БСАкалибровочный график линеен в диапазоне концентраций от 0 до 500 мкг/мл.35Чувствительность метода: Флуоресцентные методы высокочувствительныи позволяют определить от 0,25 до 25 мкг белка в пробе (объём пробы 1 мл).Преимущества метода.1) Главным преимуществом данного метода является его высокаячувствительность,чтопозволяетиспользоватьдляопределенияконцентрации очень небольшие количества белка.2) Лишь немногие соединения, которые могут находиться в раствореисследуемогобелка,влияютнафлуоресценциюпродукта(восстанавливающие агенты, хелаторы, детергенты не влияют наинтенсивность флуоресценции).3) Метод прост и быстр в исполнении.4) Широкая линейная область зависимости флуоресценции отконцентрации белка.Недостатки метода:1) Для измерения флуоресценции требуются дорогостоящие приборы,флу ори метры.2) Присутствие в препарате белка ряда соединений может оказыватьвлияние на интенсивность флуоресценции.
Прежде всего, это соединения,содержащие аминогруппы (аминокислоты, пептиды). В качестве примерабуферов, часто используемых при выделении белков, и влияющих нафлуоресценцию белкового комплекса с флуорескамином, необходимоупомянуть Трис и глициновый буферы. Их присутствие в образцеисследуемого белка увеличивает интенсивность флуоресценции, однако, этотприрост можно компенсировать, добавив такое же количество Триса илиглицина в контрольную пробу.3) Как и для ряда колориметрических методов (см. выше),интенсивность флуоресценции зависит от аминокислотного состава белка.Хотя все белки имеют концевую NH2-rpynny (в ряде случаев она может бытьмодифицирована), количество остатков лизина в различных белках можетсущественно варьировать.
Следовательно, одно и тоже количество разныхбелков будет давать существенно различающийся флуоресцентный сигнал сфлуорескамином. Поэтому, чтобы точно определить концентрациюисследуемого белка, нужно либо знать количество аминогрупп в нем, и,соответственно, его аминокислотный состав, либо использовать в качествебелка-стандарта точно такой же белок с известной концентрацией.Литература1. Остерман Л .А.
(1981) Методы исследования белков и нуклеиновыхкислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. Наука, Москва, с.98-99.362. Bohlen P., Stein S., Dairman W., Udenfriend S. (1973) Fluorometric assayo f proteins in the nanogram range. Arch. Biochem. Biophys., 155, pp. 213220.3. Chen X., Wang J.
(2006) A sequential injection fluorometric procedure forrapid determination o f total protein in human serum. Talanta, 69, pp. 681685. (http://www.sciencedirect.com).4. Held P. (2001) Fluorimetric protein quantification using the reactivecompound fluorescamine. Tech.
Resources, (http://www.biotek.com/resources/articles/.. ..html).5. Udenfriend S., Stein S., Bohlen P., Dairman W., Leimgruber W.,Weigele M.(1972) Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides andprimary amines in the picomole range. Science, 178, pp. 871-872.6. http://www.biotek.com7. http://www.sciencedirect.com4.2. Определение концентрации белка с o/wio-фталевым диальдегидом.Принцип метода. Этот метод по сути очень похож на метод определенияконцентрации белка с флуорескамином (см. выше). Также как ифлуорескамин, о-фталевый диальдегид взаимодействует с первичнымиаминами в присутствии (3-меркаптоэтанола (рис.
14). При этом образуетсяфлуоресцирующий продукт с максимумом возбуждения при 340 нм имаксимум флуоресценции при 455 нм.Рис. 14. Реакция о-фталевогоприсутствии (З-меркаптоэтанола.диальдегидаспервичнымаминомвСуществует несколько вариантов методик работы с о-фталевымдиальдегидом, позволяющих определить концентрацию белка от 50 нг/мл до500 мкг/мл. В остальном этот метод аналогичен описанному выше дляфлуорескамина.Литература1.
Ogden G., Foldi P. (1987) Aminoacid analysis; an overview o f currentmethods. LC-GC, 5, pp. 28-38.372. Roth M. Fluorescence reaction for amino acids. (1971) Anal. Chem., 43, pp.880-882.3. www.piercenet.comПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬОсновными целями данной работы является:1) Освоить широко применяемые методы определения концентрациибелка в растворе.2)Ознакомитьсястеоретическимиосноваминаиболеераспространенных методов определения концентрации белка в растворе.СеминарТема: Методы определения концентрации белка в растворе.Вопросы:1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
