М.В. Медведева, Н.Б. Гусев - Определение концентрации белка в растворе (1123317), страница 6
Текст из файла (страница 6)
(http://www.piercenet.com/browse.cfm).Реактивы:1. Рабочий раствор. 10 мг Кумасси G-250 растворяют с помощью ручногогомогенизатора стекло/стекло в 5 мл 95%-ного этанола. Полученныйраствор смешивают с 10 мл 85%-ной фосфорной кислоты и доводятобъем водой до 100 мл. После приготовления рабочий растворнеобходимо отфильтровать через бумажный фильтр и хранить втемной склянке. Раствор стабилен при комнатной температуре втечение нескольких недель, однако при длительном хранении частькрасителя может выпадать в осадок и перед использованием такойрабочий раствор необходимо вновь отфильтровать.282.
Стандартный раствор белка, например, БСА с концентрацией 1 мг/млдля макро- и 0,1 мг/мл для микрометода (для построениякалибровочного графика). Точную концентрацию БСА определяютспектрофотометрически, считая коэффициент удельного поглощенияпри 280 нм равным 0,646 мл/см*мг (см. выше).3. Исследуемый раствор белка.3.1.1. Стандартный метод.Ход работы:Вариант 1.К 100 мкл образца, содержащего от 5-50 мкг белка, добавляют 5 млрабочего раствора Кумасси G-250, тщательно перемешивают (навстряхивателе, при этом желательно избегать образования пены). Через 2-5мин инкубации при комнатной температуре измеряют оптическоепоглощение при 595 нм.Вариант 2.К 1,5 мл образца, содержащего от 10 до 50 мкг белка, добавляют 1,5 млрабочего раствора Кумасси G-250, тщательно перемешивают (навстряхивателе, при этом желательно избегать образования пены).
Через 2-5мин инкубации при комнатной температуре измеряют оптическоепоглощение при 595 нм.Величины оптического поглощения зависят не только от количествабелка в пробе, но и от длительности хранения рабочего раствора. По этойпричине следует строить калибровочный график при каждом определенииконцентрации белка.Нелинейность калибровочного графика при концентрации белка впробе 1-10 мкг/мл или тот факт, что калибровочный график не выходит изначала координат, может быть обусловлен исчерпанием количествасвободного анионного красителя.
Чтобы избежать этих проблем и улучшитьлинейность, желательно строить зависимость отношения А 595/А 450 отколичества белка, добавленного в пробу. В этом случае необходимо измеритьвеличины оптического поглощения при 595 и 450 нм для проб, содержащихтолько краситель и смесь красителя с белком, против пробы, содержащейтолько воду (т.н. абсолютные оптические поглощения).3.1.2. Микрометод.Ход работы :100 мкл образца, содержащего 1-10 мкг белка, помещают впластиковую пробирку Эппендорф на 1,5 мл, добавляют 1 мл рабочегораствора Кумасси G-250 и тщательно перемешивают (на встряхивателе).Через 2-5 мин измеряют оптическое поглощение при 595 нм.29Чувствительность метода. Чувствительность метода Бредфорд сравнима счувствительностью метода Лоури и метода определения белка сбицинхониновой кислотой, или даже превышает их. Она составляет от 0,5 до50 мкг белка в пробе (0,8-10 мкг/мл) в зависимости от объемаэкспериментальной пробы.
Так, используя стандартный метод (объем пробы5 мл), можно определить 5-50 мкг белка в пробе. Микрометод ещё болеечувствителен и позволяет определить 1-10 мкг белка (в пробе объемом 1 мл).Преимущества метода:1) Главным преимуществом данного метода является высокаячувствительность, что позволяет использовать его для определенияконцентрации очень небольших количеств белка.2) Лишь немногие соединения влияют на образующуюся окраску.3) Метод прост и быстр (2-5 мин инкубации при комнатнойтемпературе).4) Образовавшаяся окраска стабильна в течение 1 часа.Недостатки метода:1) Довольно узкая линейная область зависимости оптическогопоглощения от концентрации белка.2) Калибровочный график может не выходить из нуля (см.
выше).3) Сильнощелочные буферы и некоторые детергенты (додецилсульфатнатрия (ДСН), тритон Х-100) снижают интенсивность окраски.4) Как и для метода Лоури (см. выше), интенсивность окраски зависитот аминокислотного состава белка. «Кислые» и гидрофильные белкизначительно хуже связывают краситель, чем «щелочные» и гидрофобные.Этот факт предъявляет довольно жесткие требования к белку-стандарту.5) При использовании метода Бредфорд довольно жесткие требованияпредъявляются к лабораторной посуде и кюветам для измерения оптическогопоглощения.
Не следует использовать кварцевые кюветы, т.к. красительсорбируется на них. Не следует мыть кюветы водой, потому что принейтральных значениях pH большая часть красителя переходит в анионнуюсинюю форму, выпадает в осадок и сорбируется на стенках кюветы. Остаткикрасителя со стенок кювет лучше удалять либо этанолом, либо слабымраствором детергента (например, ДСН).Литература1.
Практикум по биохимии (под ред. Северина С.Е., Соловьевой Г.А.)(1989) Изд-во Московского университета, Москва, с. 83.2. Досон Р., Эллиот Д., Элиот У., Джонс К. (1991) Справочник биохимика,Мир, Москва, с. 466-467.3. Сафронова М.И., Зайцева Н.Н., Рубцов А.М., Гривенникова В.Г.,Рыжавская А.С., Гусев Н.Б. (2009) Основы практической биохимиибелка, Учебно-методическое пособие, МАКС Пресс, Москва, с.
17-19.4. Скоупс Р. (1985) Методы очистки белков, Мир, Москва, с. 315.305. Bradford М.М. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding. Anal. Biochem., 72, pp. 248-254.6. Kruger N.G. (2002) The Bradford method for protein quantification, in Theprotein protocols handbook (Walker J.M., ed.), Humana Presss Inc.,Totowa, NJ. pp. 15-21.7.
Spector T. (1978) Refinement o f the Coomassie blue method of proteinquantitation. Anal. Biochem., 86, pp. 142-146.8. Zor Т., Selinger Z. (1996) Linearization o f the Bradford protein assayincreases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal.Biochem., 236, pp. 302-308.14.Protein methods library. Chemistry of protein assays, pp. 3-4.http://www.piercenet.com/browse.cfm3.2. Определение белка по связыванию амидового черного (методШаффнера и Вайсмана)Принцип метода. Анионный краситель амидовый черный (рис. 11), широкоприменявшийся ранее для окраски полиакриламидных гелей и замененныйпозднее на Кумасси, может эффективно использоваться для определенияконцентрации белка.Образец белка наносят на нитроцеллюлозную мембрану и фиксируюттрихлоруксусной кислотой, после чего мембрану промывают растворомуксусной кислоты.
В этих условиях белок прочно сорбируется нанитроцеллюлозе, а все низкомолекулярные компоненты образца удаляются.Это позволяет детектировать очень малые количества белка даже вприсутствии высоких концентраций Трис, сахарозы, мочевины, ЭДТА итиоловых реагентов. Следует, однако, помнить, что так же как в случаеокрашивания Кумасси G-250, связывание амидового черного в заметнойстепени зависит от физико-химических свойств белка и «щелочные»гидрофобные белки связывают краситель лучше, чем «кислые»гидрофильные белки.Рис.
11. Структурная формула красителя амидовый черный.(http://en.wikipedia.org).31Реактивы:1. Трихрлоруксусная кислота - 20%-ный раствор (масса/объем)2. Уксусная кислота - 7%-ный раствор (объем/объем)4. Амидовый черный - 0,1%-ный раствор, приготовленный на 7%-нойуксусной кислоте5. Раствор для элюции красителя - 25 мМ NaOH, содержащий 0,05 мМЭДТА и 50%-ный этанол6. Нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0,4 мкм (можноиспользовать фильтры фирм Millipore или Synpore)7. Стандартный раствор белка, например, БСА с концентрацией 1 мг/млдля построения калибровочного графика.
Точную концентрацию БСАопределяют спектрофотометрически, считая коэффициент удельногопоглощения при 280 нм равным 0,646 мл/см*мг (см. выше).8. Исследуемый раствор белка.Ход работы:Образец белка (это может быть индивидуальный белок или экстрактткани) наносят на нитроцеллюлозную мембрану.
Желательно, чтобы объемобразца не превышал 30 мкл, а диаметр получаемого пятна не превышал 1см. В ходе нанесения нитроцеллюлозную мембрану постоянно подсушиваютфеном. Если образец велик по объему, то нанесение пробы проводят внесколько заходов, каждый раз тщательно высушивая место нанесения.После нанесения всех образцов нитроцеллюлозный фильтр помещают в20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты для фиксации белков иотмывания низкомолекулярных растворимых соединений. Удобно проводитьэту операцию в чашке Петри. Через 5-10 минут фильтры отмывают 2-3 раза врастворе 7%-ной уксусной кислоты и помещают на 1-2 минуты в растворамидового черного. Избыток красителя тщательно отмывают растворомуксусной кислоты, а затем ополаскивают водой для удаления кислоты ивысушивают под феном в токе теплового воздуха.С помощью круглых сверл для резиновых пробок вырезают равные поплощади участки нитроцеллюлозного фильтра, содержащие исследуемыеобразцы белка. В качестве контроля используется участок фильтра, которыйпрошел все вышеописанные обработки, но на который не наносили образецбелка.Вырезанные участки нитроцеллюлозной мембраны помещают впробирки Эппендорф на 1,5 мл и вносят в каждую пробирку по 1 мл растворадля элюции красителя.
Полученные пробы перемешивают и оставляют на 1-2часа, периодически встряхивая, для полной элюции красителя.Измеряют оптическое поглощение при 630 нм. Количество белкаопределяют по калибровочному графику, построенному с использованиембелка-стандарта.Чувствительность метода. Метод позволяет определить от 0,5 до 30 мкгбелка в пробе (1 мл).32Преимущества метода.1)Основнымпреимуществомметодаявляетсявысокаячувствительность, что позволяет использовать его для определения оченьнебольших количеств белка.2) Низкомолекулярные соединения не влияют на образующуюсяокраску.3) Метод довольно прост, хотя и не слишком быстр (учитывая времяэлюции белка с нитроцеллюлозы).Недостатки метода:1)Как и для метода Бредфорд (см.
выше), интенсивность окраскизависит от аминокислотного состава белка. «Кислые» и гидрофильные белкихуже связывают краситель, чем «щелочные» и гидрофобные. Кроме того,интенсивность окраски зависит от размера белка, (короткие белки и пептидылегко вымываются с нитроцеллюлозной мембраны в ходе фиксации иотмывания уксусной кислотой).Литература1. Сафронова М.И., Зайцева Н.Н., Рубцов А.М., Гривенникова В.Г.,Рыжавская А.С., Гусев Н.Б.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
