М.В. Медведева, Н.Б. Гусев - Определение концентрации белка в растворе (1123317), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Эти пробы могут не отличаться по содержаниюбелка или иметь его разное количество. Главное, чтобы величиныоптического поглощения этих проб находились в пределах оптическогопоглощения проб, используемых для построения калибровочного графика.После измерения оптического поглощения во всех пробах и построениякалибровочного графика, по нему определяют содержание белка в«параллельных»опытныхпробахирассчитываютнеизвестную13концентрациюбелка,усредняязначение(есликонцентрация«параллельных» пробах отличается не более чем на 10%).2.1.вБиуретовый методПринцип метода. Метод основан на взаимодействии ионов меди спептидной связью белков и пептидов при щелочных значениях pH собразованием фиолетового комплекса. Биуретовым он называется потому,что подобный сине-фиолетовый комплекс с медью образует также биурет продукт конденсации двух молекул мочевины, образующийся принагревании (рис.
4).NH20=СЛI2 С = 0180“С\---------►1NH+NH3о0 —— суnh2nh2М очевинаБиуретРис. 4. Образование биурета. (http://imeges.google.ru).Поскольку белок и биурет содержат в своем составе пептидные связи (рис.5), структура комплексов, образованных с ионами меди белком и биуретом,сходна (рис. 6).0о о1HjNINHjHjNМ очевинаINнNH2БиуретоноПепт идРис.5.Структурамочевины,(http://www.piercenet.com/browse.cfrn).14биуретаипептида.\С/ N| \yR/ ! нчОс\!ЖУ-R-^srсоR .N~.'Ср\\О -:сн/Iо*/Н/ ° нс.;N .С-,r/сгнО-(а)H N = 0 — N H s\НгОI,-HjNС— NHINH.. +•+ .>Cu<;.** • *•С— О-/HNIо -—Сн2о/N H '-’'-HN(б)Рис.
6. Постулируемые структуры биуретового комплекса, (а) Комплексымеди с фрагментом полипептидной цепи [Штрауб, 1963]. (б) Структуракомплекса моноиминобиурета с ионами Cu2+ [Rising and Yang, 1933].Установить точную структуру биуретового комплекса, образуемогоСи2+ с различными участками полипептидной цепи практически невозможно.Однако, основываясь на опытах, проведенных на модельных соединениях(таких как моноиминобиурет (рис. 66)), постулируется, что Си2+ можетобразовывать комплекс, в состав которого входят 4 атома азота и два атомакислорода, принадлежащие карбонильным группам полипептидной цепи15(рис.
6а) или двум молекулам воды (рис. 66).Некоторые свободныеаминокислоты (особенно гистидин, серии, треонин и аспарагин), а такженекоторые дипептиды вступают в биуретовую реакцию и образуют при этомсравнительно слабо окрашенные соединения, в то время как трипептиды иболее длинные пептиды образуют в ходе биуретовой реакции интенсивноокрашенные комплексы.Биуретовый комплекс имеет максимум оптического поглощения при540 нм (рис. 7), причем положение максимума может незначительноварьировать в зависимости от аминокислотного состава белка.АЦ лииа волны, и мРис.
7. Спектр поглощения продукта, образующегося при проведениибиуретовой реакции с БСА.При длине волны меньше 400 нм (рис. 7) оптическое поглощениебиуретового комплекса существенно возрастает, однако явно выраженногомаксимума в диапазоне длин волн 300-400 нм не наблюдается. Величинаоптического поглощения при 330 нм довольно сильно зависит отаминокислотного состава белка.Описано много вариантов биуретового метода, позволяющихувеличить интенсивность или стабильность окраски, а также исключитьвлияние на нее различных компонентов инкубационной среды.
Существуюттак называемые макро- и микрометоды, в первую очередь различающиесяпо чувствительности и, следовательно, по количеству белка, необходимомудля определения его концентрации. В обоих случаях при приготовлениибиуретового реактива используют соединения, поддерживающие медь вионизированном состоянии в виде хелатов (в макрометоде - это сегнетовасоль, в микрометоде - это лимонная кислота), чтобы предотвратитьобразование в щелочной среде нерастворимой в воде гидроокиси меди (11):C 11SO4 + NaOH -> Cu(OH)2J + Na2S 0 416(11)2 . 1.
1. М акром ет од.Реактивы:1. Стандартный раствор белка, например, БСА с концентрацией 10 мг/мл(для построения калибровочного графика). Точную концентрацию БСАопределяют спектрофотометрически, считая коэффициент удельногопоглощения при 280 нм равным 0,646 мл/см*мг (см. выше).2. NaOH - 10%-ный раствор, свободный от карбонатов (Na2CO^)3. Биуретовый реактив для макроопределения: 0,15 г C uS04*5H20 и 0,6 гNaKC4H406*4H20 (виннокислый натрий-калий или сегнетова соль, илитартрат натрия-калия) растворяют в 50 мл воды при интенсивномперемешивании. К этому раствору добавляют 30 мл 10%-ного раствораNaOH (масса/объём), свободного от карбонатов, и 0,1 г KJ (дляпредотвращения образования осадка оксида меди (I)). Объем доводятводой до 100 мл. Хранят раствор в полиэтиленовой посуде.4.
Исследуемый раствор белка.Ход работы:Вариант 1.К 200 мкл раствора, содержащего от 0,4 до 2 мг белка, добавляют 800мкл биуретового реактива и инкубируют пробы при комнатной температуре30 минут, после чего колориметрируют при 540 нм (540-560 нм).Если возникают проблемы с измерением оптического поглощения вобразцах с малыми объемами, то используют следующую модификацию.Вариант 2.К 1 мл раствора, содержащего от 2 до 10 мг белка, добавляют 4 млбиуретового реактива, и после инкубации в вышеописанных условиях пробыколориметрируют при 540 нм (540-560 нм).В обоих случаях содержание белка в исследуемом растворерассчитывают по калибровочному графику.Чувствительность метода. В зависимости от объема пробы макрометодпозволяет определять от 0,4 до 2 мг белка в пробе объемом 1 мл и от 2 до 10мг белка в пробе 5 мл, соответственно.Для разных белков величины оптического поглощения незначительноотличаются (не более чем в 2 раза).
Однако ошибка определенияконцентрации белка этим методом меньше, чем другими.Преимущества метода. Безусловным преимуществом этого методаявляются:1) Простота исполнения и надежность.2) Высокая специфичность, поскольку число соединений небелковойприроды, влияющих на определения белка этим методом, невелико(исключения см. ниже).173)Чувствительность биуретового метода практически не зависит отаминокислотного состава белка, так как это реакция в основном напептидную связь.Недостатки метода. Как у любого метода, у биуретовой реакции естьсущественные недостатки.1) Определению концентрации белка биуретовым методом могутмешать различные соединения: (1) способные образовывать комплексы сионами меди (ЭДТА, ЭГТА, аммиак, соли аммония); (2) образующиеокрашенный комплекс с ионами меди (пептиды, Трис, сахароза и желчныепигменты); (3) вызывающие помутнение раствора (липиды и детергенты).2) Главным недостатком этого метода являетсяего низкаячувствительность, поэтому он не пригоден для определения небольшихконцентраций белка, что ограничивает его применение.2.1.2.
Микрометод.Реактивы:1. Стандартный раствор белка, например, БСА, с концентрацией 1 мг/мл(для построения калибровочного графика). Точную концентрацию БСАопределяют спектрофотометрически, считая коэффициент удельногопоглощения при 280 нм равным 0,646 мл/см*мг (см. выше).2. Биуретовый реактив для микроопределения (реактив Бенедикта): 17,3 гтрехзамещенного цитрата натрия (№зСбН50 7*5,5 Н20 ) и 10 г Na2CO;растворяют при нагревании в небольшом количестве воды. В раствордобавляют 1,73 г C uS04*5H20, растворенного в 10 мл воды и доводятобъём водой до 100 мл.3.
NaOH - 6%-ный водный раствор.4. Исследуемый раствор белка.Ход работы:К 2 мл раствора, содержащего 0,1-2 мг белка, добавляют 2 мл 6%-ноговодного раствора NaOH и 0,2 мл реактива Бенедикта. Пробу хорошоперемешивают и через 15 мин фотометрируют при 330 нм.Содержание белка в исследуемом растворе рассчитывают покалибровочному графику.Чувствительностьметода.Микрометодобладаетбольшейчувствительностью, чем макрометод и позволяет определить от 0,1 до 2 мгбелка в пробе (объем пробы 4,4 мл).
В первую очередь это связано с тем, чтоизмерения оптического поглощения в данном случае проводят при длиневолны не 540 нм, а 330 нм или даже 310 нм, при этомв ближнейультрафиолетовой области спектра (рис. 7) наблюдается более интенсивноепоглощение биуретового комплекса.18Преимущества метода. Как и в случае макробиуретового метода,преимуществом микрометода является:1) Простота и надежность (см.
выше).2) Этот вариант метода заметно более чувствителен, что позволяетсущественно уменьшить количество используемого белка при определенииего концентрации.Недостатки метода. Основными недостатками метода (как и в случаемакрометода) остаются:1) Зависимость развивающейся окраски от присутствия в пробе рядасоединений (см. выше).2) Относительно невысокая чувствительность.Литература1. Практическая химия белка (под ред. Дарбре А.) (1989) Мир, Москва, с.290-302.2. Практикум по биохимии (под ред. Северина С.Е., Соловьевой Г.А.)(1989) Изд-во Московского университета, Москва, с.
80-81.3. Диксон М., Уэбб Э. (1982) Ферменты, Мир, Москва, с. 49.4. Досон Р., Эллиот Д., Элиот У., Джонс К. (1991) Справочник биохимика,Мир, Москва, с. 465-466.5. Сафронова М.И., Зайцева Н.Н., Рубцов А.М., Гривенникова В.Г.,Рыжавская А.С., Гусев Н.Б. (2009) Основы практической биохимиибелка, Учебно-методическое пособие, МАКС Пресс, Москва, с.
9-11.6. Скоупс Р. (1985) Методы очистки белков, Мир, Москва, с. 311.7. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. (1981) Основыбиохимии, Мир, Москва, т. 1, с. 119.8. Штрауб Ф.Б. (1963) Биохимия, АН Венгрии, Будапешт, с.56.9. Gornall A.G., Bardawill C.J., David М.М. (1949) Determination of serumproteins by means of the biuret reaction. J. Biol.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
