М.В. Медведева, Н.Б. Гусев - Определение концентрации белка в растворе (1123317), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Таким образом, при определении концентрациибелка по методу Лоури необходимо проведение двухстадийной реакции, врезультате которой сначала образуется биуретовый комплекс при щелочныхзначениях pH, а затем - молибденовая синь при нейтральных или кислыхзначениях pH.Бицинхониновая кислота является специфическим хелатором ионоводновалентной меди (рис. 8). Смит и соавт. постулировали, что ионы Си+образуются в двух независимых реакциях: при окислении определенныхаминокислотных остатков белка (цистеина, тирозина, триптофана и др.) ипри взаимодействии Си2+ с определенными пептидными связями белка.Образующийся комплекс бицинхониновой кислоты и ионов одновалентноймеди стабилен при щелочных значениях pH, т.е.
в условиях протеканиябиуретовой реакции. По этой причине в отличие от метода Лоури реакцию сбицинхониновой кислотой можно проводить в одну стадию при щелочныхзначениях pH. Помимо этого, оказалось, что многие соединения, мешающиеопределению концентрации белка по методу Лоури, не влияют (или оченьнезначительновлияют)наопределениеконцентрациибелкасбицинхониновой кислотой.В результате реакции с бицинхониновой кислотой образуется хорошорастворимый в воде малиновый комплекс (максимум оптическогопоглощения при длине волны 562 нм; поглощение можно измерять прилюбой длине волны от 550 до 570 нм, при этом оптическая плотность будетменяться менее чем на 10%).В литературе описаны стандартный и микрометод определенияконцентрации белка с бицинхониновой кислотой, на порядок различающиесяпо чувствительности (см.
ниже).23+СиБицинхониновая кислота(БХК)оооо€ооОКомплекс БХ К с ионами Си+8. Образование комплекса бицинхониновой кислотыодновалентной меди, (http://www.piercenet.com/browse.cfm).Р ис.сионами2.3.1. Стандартный метод.Реактивы:1. Реагент А :бицинхониновая кислота (натриевая соль) - 0,1 г,Na2C 0 3*H20 - 2,0 г,двухводныйвиннокислыйнатрий(тартратнатрия)Na2C4H40 6*2H20 - 0,16 гNaOH - 0,4 г,N aH C03 - 0,95 гНавески растворить в воде и довести объем до 100 мл. Проверить pH ипри необходимости довести его значение до 11,25 с помощью NaOHили N aH C 03.2. Реагент Б:C uS0 4*5H20 - 0,4 г растворить в 10 мл воды.Реагенты А и Б стабильны неограниченно долгое время при комнатнойтемпературе.3.
Стандартный рабочий раствор: Смешать реагенты А и Б всоотношении 100:2 (по объёму). Раствор стабилен при комнатнойтемпературе в течение 1 недели.4. Стандартный раствор белка, например, БСА с концентрацией I мг/мл(для построения калибровочного графика). Точную концентрацию БСАопределяютспектрофотометрически,принимаякоэффициентудельного поглощения при 280 нм равным 0,646 мл/см»мг (см. выше).5. Исследуемый раствор белка.Ход работы:К 100 мкл раствора, содержащего 10-100 мкг белка, добавляют 2 млстандартного рабочего раствора и инкубируют при 60°С в течение 30 мин.24При увеличении времени инкубации интенсивность окраски увеличивается.После окончания нагревания окраска стабильна по крайней мере в течение 1часа.
Остудив пробы до комнатной температуры, измеряют их оптическоепоглощение при 562 нм и определяют концентрацию белка покалибровочному графику.2.3.2. Микрометод.Реактивы:1. Реагент А :C uS04*5H20 - 0,4 г в 10 м л воды2. Реагент Б:бицинхониновая кислота (натриевая соль) - 4,0 г в 100 мл воды3. Реагент В:Na2C 0 3*H20 - 0,8 г,NaOH - 1,6 г,двухводный тартрат натрия Na2C4H40 6*2H20 - 1,6 гНавески растворить в воде и довести объем до 100 мл водой. ПроверитьpH раствора и при необходимости довести его значение до 11,25 спомощью 10 М раствора NaOH.4.
Стандартный рабочий раствор: смешать реагенты А и Б в соотношении1:25 (по объему) и добавить к ним 26 объемов реагента В.5. Стандартный раствор белка, например, БСА с концентрацией 0,01мг/мл(дляпостроениякалибровочногографика).Точнуюконцентрацию БСА определяют спектрофотометрически, считаякоэффициент удельного поглощения при 280 нм равным 0,646мл/см*мг (см. выше).6. Исследуемый раствор белка.Ход работы:К 1 мл раствора, содержащего от 0,5 до 10 мкг белка в мл, добавить 1мл стандартного рабочего раствора и инкубировать в течение I часа при60°С. Остудить и измерить оптическое поглощение при 562 нм.
Определитьконцентрацию белка по калибровочному графику.Чувствительность метода.Чувствительность стандартногометодаопределения концентрации белка с бицинхониновой кислотой сравнима счувствительностью метода Лоури и составляет 10-100 мкг белка в пробе(объем пробы 2 мл). Микрометод ещё более чувствителен и позволяетопределить 0 ,5 - 1 0 мкг белка в пробе объемом 2 мл.Преимущества метода.1)Главным преимуществом данного метода является его высокаячувствительность.252) Лишь немногие соединения (в отличие от метода Лоури) влияют наобразующуюся окраску.3) Окраска стабильна в течение довольно длительного времени.4) Зависимость оптического поглощения от количества белка в пробелинейна в широком диапазоне.5) Аминокислотный состав белка слабо влияет на интенсивностьокрашивания.Недостатки метода.
К недостаткам метода следует в первую очередьотнести:1) Длительную инкубацию проб (30-60 мин) при высокой температуре(60°С).2) Среди соединений, значительно мешающих проведению реакции,нужно упомянуть глюкозу, которая в концентрации 50-100 мМ сильнозавышает результаты определения концентрации белка, а также ЭДТА иионы аммония, которые в концентрациях 10-100 мМ и 10-20 мМ,соответственно, сильно занижают результаты.3) Как и для метода Лоури (см.
выше), интенсивность окраскидовольно сильно зависит от аминокислотного состава белка, что накладываетопределенные требования на выбор белка-стандарта и не позволяетабсолютно точно определить концентрации разных белков.Литература1. Сафронова М.И., Зайцева Н.Н., Рубцов А.М., Гривенникова В.Г.,Рыжавская А.С., Гусев Н.Б. (2009) Основы практической биохимиибелка, Учебно-методическое пособие, МАКС Пресс, Москва, с. 15-17.2.
Smith Р.К., Krohn R.I., Hermamson G.T., Mallia А.К., Gartner F.H.,Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C.(1985) Measurement o f protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem.,150, pp. 76-85.3. Walker J.M. (2002) The bicinchoninic acid (BCA) assay for proteinquantitation, in The protein protocols handbook (Walker J.M., ed.), HumanaPresss Inc., Totowa, NJ., pp. 11-14.4. Wiechelman K.J., Braun R.D., Fitzpatrick J.D.
(1988) Investigation of thebicinchoninic acid protein assay: identification o f the groups responsible forcolor formation. Anal. Biochem., 175, pp. 231-237.5. Protein methods library. Chemistry o f protein assays, p. 2.http://www.piercenet.com/browse.cfm3. Определение концентрации белкаметодами по связыванию красителейколориметрическимиВ ряде исследований было замечено, что при связывании белка снекоторыми органическими красителями спектр поглощения последних26меняется. Образуется окрашенный комплекс красителя с белком,интенсивностьокраскикотороговопределенномдиапазонепропорциональна концентрации белка в пробе.Существует большое количество красителей, способных связываться сбелками, и, соответственно, много методов, использующих это свойство дляопределения концентрации белка.
Наибольшее распространение получилиметод Бредфорд с использованием Кумасси и метод Шаффнера и Вайсмана сиспользованием амидового черного.3.1. Определение концентрации белка по связыванию Кумасси (методБредфорд)Анионный краситель Кумасси G-250 (Coomassie Brilliant blue G-250) имеетнесколько ионогенных групп: две сульфогруппы с рК 1,15, 1,82 и группу,содержащую третичный атом азота, с рК 12,4 (рис. 9). При кислых значенияхpH Кумасси G-250 находится в виде двух протонированныхформ смаксимумами поглощения при 465-470 и 650 нм и имеет буро-коричневоеокрашивание. При связывании красителя с белком в кислой среде образуетсякомплекс с новым максимумом оптического поглощения в районе 590-595нм (рис.
10). Таким образом, измеряя оптическое поглощение при длиневолны 595 нм, т.е. количество красителя, связавшегося с белком, можноопределить концентрацию белка.Анионная форма красителя преимущественно связывается сположительно заряженными остатками аргинина, лизина и гистидина, атакже вступает в гидрофобные взаимодействия с белком. По этой причинеболее щелочные и гидрофобные белки лучше связывают Кумасси G-250, чемболее кислые и полярные. Вследствие этого интенсивность окрашиваниядовольно сильно зависит от природы и аминокислотного состава белков.Свободные аминокислоты и пептиды не образуют окрашенный комплекс скрасителем (для образования окрашенного комплекса с Кумасси G-250молекулярная масса пептида должна превышать 3 кДа).Метод Бредфорд имеет чувствительность, сопоставимую, или даженесколько более высокую, чем метод Лоури. Более того, многие соединения,мешающие определению концентрации белка по методу Лоури, не влияют наопределение концентрации белка по методу Бредфорд.
Окраска развиваетсяпри комнатной температуре в течение всего 2-5 мин. Все это сделало методБредфорд очень популярным.Различают стандартный и микрометод определения концентрациибелка с помощью Кумасси, отличающиеся по объему проб и почувствительности.27Рис.9.Структурнаяформула(http://www.piercenet.com/browse.cfm).красителяКумассиG-250.АД ли н а волны, нмРис. 10. Спектры поглощения Coomassie G-250 в кислой среде в отсутствиебелка и в присутствии БСА: - 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 (жирнаялиния) мкг/мл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
