М.В. Медведева, Н.Б. Гусев - Определение концентрации белка в растворе (1123317), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Chem., I l l , pp. 751 -766.10.Hortin G.L., Meilinger B. (2005) Cross-reactivity of amino acids and othercompounds in the biuret reaction: interference with urinary peptidemeasurements. Clin. Chem., 51, pp. 1411-1419.11 .Itzhaki R.F., Gill D.M. (1964) A micro-biuret method for estimating protein.Anal.
Biochem., 9, pp. 401-410.12.Protein methods library. Chemistry of protein assays.http://www.piercenet.com/browse.cfm13.Rising M.M., Yang P.S. (1933) The biuret reaction. III. The biuret reactionof amino acid amides. J. Biol. Chem., 99, pp. 755-765.14.http://www.expasv.ch2.2. Метод Лоури и соавторовМетод основан на образовании окрашенных продуктов, которыеполучаются в результате двух реакций. В ходе первой, биуретовой реакции,19ионы двухвалентной меди в щелочной среде образуют комплекс спептидными связями.
Часть ионов меди, находящихся в окруженииопределенных аминокислотных остатков, восстанавливается до Си 4 и приэтом происходит окисление остатков тирозина, триптофана, цистеина, атакже гистидина, аргинина, лизина, пролина и метионина. В ходе второйреакции, протекающей в кислой или нейтральной среде, ионы Си+окисляются до Си2+. Эта реакция сопряжена с восстановлениемфосфомолибдатов и фосфовольфраматов, входящих в состав реактиваФолина-Чиокальтеу, до молибденовой сини - смеси различных окисловмолибдена с переменной валентностью (возможный состав: Мо802 з*8Н20 ,Мо40 „»Н 20 , МогОз'НгО). Точный химический механизм этих реакцийостается не вполне понятным, однако, в результате их комбинацииразвивается синее окрашивание, интенсивность которого зависит отконцентрации белка.Эффективность восстановления ионов меди в определенной степенизависит от аминокислотного состава белка, поэтому метод Лоури, так же каки большинство других колориметрических методов, не обеспечиваетполучения абсолютных значений концентрации белка.
Тем не менее, онвысоко чувствителен и традиционно широко используется в биохимическихисследованиях.В литературе описано много вариантов измерения концентрации белкапо методу Лоури. Эти модификации исходной методики позволяютулучшить линейность калибровочного графика, повысить чувствительностьметода или избежать влияния различных соединений на протекание реакции.2.2.1. Стандартный метод.Реактивы:1. Стандартный раствор белка, например, БСА с концентрацией 0,2 мг/мл(для построения калибровочного графика). Точную концентрацию БСАопределяют спектрофотометрически, считая коэффициент удельногопоглощения при 280 нм равным 0,646 мл/см*мг (см.
выше).2. Цитрат натрия трехзамещенный (№ зС 6Н 507 *5 ,5 Н20 ) - 1%-ный раствор3. N aO H -0 ,1 М раствор4. Na 2C 0 3 - 2%-ный раствор в 0,1 М растворе NaOH5. C uS0 4*5Hi0 - 0,5%-ный раствор в 1%-ном трехзамещенном цитратенатрия.6 . Рабочий раствор: непосредственно перед определением 1 мл реактива 5смешивают с 50 мл реактива 4.7. Реактив Фолина-Чиокальтеу - коммерческий препарат, содержащийсоли молибдена и вольфрама (разбавляется водой до концентрации покислоте I М (обычно требуется -2-кратное разбавление)); хранится втемной посуде при +4°С.8.
Трихлоруксусная кислота - 10%-ный раствор9. Исследуемый раствор белка.20Ход работы:К 0,4 мл исследуемого раствора, содержащего от 10 до 80 мкг белка,добавляют 2,0 мл рабочего раствора (реактив 6), перемешивают и оставляютпри комнатной температуре на 10 мин. Добавляют 0,2 мл реактива ФолинаЧиокальтеу, содержимое пробирок быстро и тщательно перемешивают ичерез 30 мин колориметрируют при 750 нм. Содержание белка в проберассчитывают по калибровочному графику.Калибровочный график в интервале от 10 до 80 мкг белка в пробеимеет незначительные отклонения от линейной зависимости.
Еслисодержание белка в пробе велико, а калибровочный график начинаетотклоняться от линейности при высоких концентрациях белка, токолориметрирование лучше проводить при 650 или даже 550 нм. В этомслучае чувствительность метода уменьшается, однако увеличивается областьлинейности.Поскольку метод Лоури чувствителен к присутствию в реакционнойсреде большого числа веществ (см. ниже), бывает целесообразно сначалаосадить белок, а потом повторно растворить его в щелочном растворе.
Дляэтого в белковый раствор добавляют трихлоруксусную кислоту до конечнойконцентрации 3-4% и оставляют пробу на льду на 10-20 мин. Осадок белкаотделяют центрифугированием и промывают сначала 2%-ным растворомтрихлоруксусной кислоты, а затем ацетоном и высушивают на воздухе(супернатант отбрасывают). Высушенный осадок растворяют в минимальномобъеме 1 М NaOH, разводят водой до желаемой концентрации и определяютсодержание белка по методу Лоури.Чувствительность метода. Метод Лоури характеризуется довольно высокойчувствительностью и позволяет определить от 10 до 80 мкг белка в пробе(объем пробы 2,6 мл).Преимущества метода.1)Главным преимуществом метода Лоури является его высокаячувствительность, позволяющая экономно расходовать белковый растворпри определении его концентрации.Недостатки метода.
У метода Лоури довольно много существенныхнедостатков.1) Метод сильно зависим даже от малых изменений pH.2) Довольно узкая линейная область зависимости оптическогопоглощения от концентрации белка.3) Поскольку на интенсивность окраски существенное влияниеоказывает аминокислотный состав белка, одни и те же количества разныхбелков дают разные величины оптического поглощения. Этот факт следуетучитывать при выборе белка-стандарта для построения калибровочногографика (по аминокислотному составу он не должен существенногоотличаться от исследуемого белка).214)Многие широко используемые биохимические реагенты мешаютколичественному определению белка.
К таким веществам относятся:компоненты буферных систем (Трис, Трицин, Хепес, глицил-глицин,гистидин, цитрат, фосфат в высокой концентрации), восстановители, в томчисле тиоловые соединения (дитиотрейтол, меркаптоэтанол, аскорбиноваякислота, редуцирующие сахара), комплексоны (ЭДТА, ЭГТА), детергенты(тритон Х-100), свободные аминокислоты (тирозин, триптофан и цистеин) ивсе те соединения, которые оказывают влияние на биуретовый метод(сернокислый аммоний, мочевина, сахароза и многие другие) (см. выше).Для того чтобы исключить влияние указанных веществ на окрашиваниепроб, содержащих белок, контрольная проба (без белка) должна содержатьэти соединения в такой же концентрации, как и опытная проба.
В рядеслучаев проще избавиться от низкомолекулярных компонентов, мешающихопределению концентрации белка, с помощью диализа или гель-фильтрации.Можно осадить белок из раствора, например, трихлоруксусной (конечнаяконцентрация 2,5-3%) или хлорной кислотой (конечная концентрация 0,250,30 М), и повторно растворить осадок белка в щелочном растворе (см.выше).Литература1. Практическая химия белка (под ред.
Дарбре А.) (1989) Мир, Москва, с.290-302.2. Практикум по биохимии (под ред. Северина С.Е., Соловьевой Г.А.)(1989) Изд-во Московского университета, Москва, с. 81-82.3. Досон Р., Эллиот Д., Элиот У., Джонс К. (1991) Справочник биохимика,Мир, Москва, с. 466.4. Сафронова М.И., Зайцева Н.Н., Рубцов А.М., Гривенникова В.Г.,Рыжавская А.С., Гусев Н.Б. (2009) Основы практической биохимиибелка, Учебно-методическое пособие, МАКС Пресс, Москва, с. 12-14.5. Скоупс Р. (1985) Методы очистки белков, Мир, Москва, с. 311-312.6. Folin О., Ciocalteau V. (1927) Tyrosine and tryptophan determination inproteins.
J. Biol. Chem., 73, pp. 627-650.7. Legler G., Muller-Platz C.M., Mentges-Hettkamp М., Pflieger G„ Julich E.(1985) On the chemical basis o f the Lowry protein determination. Anal.Biochem., 150, pp. 278-287.8. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. (1951) Proteinmeasurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193, pp. 265275.9. Peterson G.L. (1979) Review o f the Folin phenol protein quantitationmethod o f Lowry, Rosenbrough, Farr, and Randall. Anal. Biochem., 100, pp.201 - 220 .lO.Sozgen K., Cekic S.D.,Tuten E., Apak R. (2006) Spectrophotometric totalprotein assay with copper(II)-neocuprine reagent in alkaline medium.Talanta, 68, pp. 1601-1609.221 l.Stadtman E.R.
(1993) Oxidation of free amino acids and amino acid residuesin proteins by radiolysis and by metal-catalyzed reactions. Anrn. Rev.Biochem., 62, pp. 797-821.12.Waterborg J.H. (2002) The Lowry method for protein quantitation, in Theprotein protocols handbook (Walker J.M., ed.), Humana Presss Inc.,Totowa, NJ, pp. 7-10.13. Protein methods library. Chemistry of protein assays, p. 3.http://www.piercenet.com/browse.cfm2.3.
Определение концентрации белка с бицинхониновой кислотойПринцип метода. Как уже отмечалось, при щелочных значениях pH ионыдвухвалентной меди образуют комплексные соединения с пептидной связью,что способствует восстановлению меди до Си+. Одновалентная медь можетвновь окисляться, что в случае метода Лоури приводит к образованиюмолибденовой сини, и эта реакция протекает только при кислых илинейтральных значениях pH.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
