М.В. Медведева, Н.Б. Гусев - Определение концентрации белка в растворе (1123317), страница 2
Текст из файла (страница 2)
При определении оптического поглощениябелок должен находиться в растворителе, не поглощающем при 280 нм. Еслидля измерений используют уже имеющийся белковый раствор, необходимобыть уверенным, что другие компоненты раствора (соли, буфер и т.п.)существенно не искажают результат измерения. В том случае, еслинеобходимо приготовить раствор белка из сухого препарата, его навескурастворяют в воде или в буферном растворе, в качестве которого можноиспользовать фосфатный буфер (например, 5 мМ К-фосфатный буфер, pH7,0) или смесь равных объемов фосфатного буфера и сульфата калия(конечная концентрация 50 мМ).
В ряде случаев добавление солипрепятствует агрегации белка и помогает избежать сорбции белка на стенкахкюветы.Полученный раствор должен быть абсолютно прозрачным. Еслиобразец белка не полностью растворился, то полученный растворцентрифугируют или фильтруют через мелкопористый фильтр.
При этомприходится мириться с тем, что при фильтровании часть не полностьюрастворенного белка будет потеряна на фильтре.Необходимость этих процедур обусловлена тем, что мутные растворыобладают сильным светорассеянием, вследствие чего измеренное при 280 нмпоглощение оказывается сильно завышенным. В любом случае, даже послецентрифугирования или фильтрования желательно записать спектрпоглощения полученного раствора или измерить оптическое поглощение при280 и 310 нм. Белки, не содержащие хромофоров, не поглощают при 310 нм,поэтому оптическое поглощение при 310 нм отражает в основном вкладсветорассеяния. Вычитая поглощение при 310 нм из поглощения при 280 нм,можно получить более точные значения концентрации белка (7).С - А28о- Азю(7)Для того чтобы одновременно учесть вклад нуклеотидов (нуклеиновыхкислот) и светорассеяние, рассчитать концентрацию белка можно помодифицированной формуле Калькара (8):С —(1,55 • А 28о—0,76 • А2бп) —Азю(8)Все измерения необходимо проводить в кварцевых кюветах, используяв качестве контроля растворитель, применяемый для приготовления растворабелка.Преимущества метода.1) Неоспоримые преимущества спектрофотометрического методаопределения концентрации белка состоят в том, что он прост, как правило, нетребует приготовления дополнительных реактивов, а само измерениепроводится достаточно быстро.2) В ходе определения не происходит повреждения структуры белка ипосле измерения концентрации образец может быть использован вдальнейшей работе.Недостатки метода.1) Многие компоненты буферных растворов и многие органическиесоединения (пигменты, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и др.) обладаютсильным поглощением в этой области спектра, поэтому даже небольшиеколичества этих соединений в препарате белка могут значительно искажатьполучаемые результаты.2)Точноеопределениеконцентрациисмесибелковспектрометрическим методом a priori невозможно потому, что каждыйбелок обладает спектром поглощения, отличным от спектра поглощениядругих белков, а точное содержание этого белка в составе смеси такженеизвестно.
Использование усредненного коэффициента поглощения,принимаемого равным единице, позволяет только приблизительноопределить концентрацию белков в смеси.3) Для измерений в ультрафиолетовой области требуются довольнодорогостоящие приборы и кварцевые кюветы.1.2. Спектрофотометрический метод определения концентрации белкапо поглощению в далекой ультрафиолетовой области (205-240 нм)Принцип метода. Пептидная связь обладает максимальным поглощениемвблизи 190 нм. К сожалению, работа в этой области спектра требуетспектральных приборов очень высокого класса и усложняется тем, что в этойчасти спектра также поглощает огромное количество различных соединений.Поэтому предпочитают проводить измерения при более высоких длинахволн, например, при 205 нм, когда поглощение пептидной связи примерно в2 раза меньше, чем при 190 нм.
Для большинства белков с концентрацией 1мг/мл поглощение при 205 нм составляет 30-35, а при 210 нм - 20-24единицы. Следует учесть, что поглощение при 205 нм определяется нетолько пептидной связью, но и остатками Trp, Phe, Туг, His, Cys, Met и Arg(расположены по мере убывания их вклада).9А(а)А(б)Рис. 2. Спектр поглощения бычьего сывороточного альбумина (БСА0,2 мг/мл): (а) вся ультрафиолетовая область спектра; (б) ближняяультрафиолетовая область.Измерение оптического поглощения белкового раствора в далекойультрафиолетовой области.
Белок, находящийся в растворителе (в воде илив буферном растворе), не поглощающем при длине волны 205 нм (см. выше),центрифугируют или фильтруют. Этот этап очень важен, поскольку вкладсветорассеяния в далекой ультрафиолетовой области особенно значителен,что может привести к существенным ошибкам измерений.10Оптическое поглощение раствора измеряют при 205 нм и 280 нм.Используя эмпирическую формулу, предложенную Скоупсом (9), можноопределить коэффициент удельного поглощениялюбого белка при 205 нм(А 2051 мг/мл) с ошибкой не более 2%:А 2о5 1«г/мл = 27+ 120 • (А280/А205)(9)Строго говоря, указанная формула применима только для растворовбелка в 6 М гуанидинхлориде, но отсутствие гуанидинхлорида вноситошибку не более 10%.Проведя измерения при 215 и 225 нм, можно воспользоваться другойэмпирический формулой (10):С = 144 • (А 215-А 225)где(Ю)С - концентрация белка (мкг/мл)Этот подход позволяет измерять концентрацию белка в интервале от1,5 до 50 мкг/мл.Преимущества метода.1) Неоспоримым преимуществом данного метода является в первуюочередь то, что при измерении оптического поглощения в далекойультрафиолетовой области индивидуальные различия аминокислотногосостава не играют столь значительной роли, как при измерении в ближнейультрафиолетовой области.
Это позволяет с высокой чувствительностьюпроводить почти абсолютные измерения концентрации белка.2) Как и в случае измерения поглощения при 280 нм, этот метод неприводит к повреждению исследуемого образца и после измерения белокможно использовать для дальнейших исследований.Недостатки метода. Недостатки метода практически совпадают срассмотренными выше.1) Очевидно, что при измерении в далекой ультрафиолетовой областинеобходимо использовать прецизионные специально откалиброванныевысококачественныеоптическиеприборыикварцевыекюветы,пропускающие свет с длиной волны меньше 215 нм.2) Компоненты используемых буферных растворов не должныпоглощать в далекой ультрафиолетовой области спектра (это такиесоединения как хлорид натрия, сульфат аммония, борат, фосфат и др.).3) Этот метод нельзя использовать для определения концентрациибелков в растворах, содержащих пигменты, нуклеотиды, нуклеиновыекислоты, а также кофакторыи коферменты (такие как гем,пиридоксальфосфат, тиаминпирофосфат), сильно поглощающие в этойобласти спектра.11Литература1.
Практическая химия белка (под ред. Дарбре А.) (1989) Мир, Москва, с.290-302.2. Практикум по биохимии (под ред. Северина С.Е., Соловьевой Г.А.),(1989) Изд-во Московского университета, Москва, с. 5-7.3. Сафронова М.И., Зайцева Н.Н., Рубцов А.М., Гривенникова В.Г.,Рыжавская А.С., Гусев Н.Б. (2009) Основы практической биохимиибелка. Учебно-методическое пособие, МАКС Пресс, Москва, с. 5-9.4. Скоупс Р.
(1985) Методы очистки белков, Мир, Москва, с. 312-314.5. Aitken A., Learmonth М.Р. (2002) Protein determination by UV absorption,in The protein protocols handbook (Walker J.M., ed.), Humana Press Inc.,Totowa, NJ., pp. 3-6.6. http://www.expasv.ch7. http://cc.chem.pitt.edu8. http://www.campbell.edu/facultv/nemecz/323 lect/amino/imeges/spectrum.im2. КолориметрическиебелкаметодыопределенияконцентрацииЛюбыеколориметрические методыпредполагают проведениехимических реакций, в результате которых образуется окрашенныйрастворимый продукт. При этом интенсивность окраски такого раствора,которую можно измерить с помощью оптического прибора, прямопропорциональна содержанию исходного вещества, вступившего в реакцию.Колориметрические методы широко используют для определенияконцентрации белка в растворе.
Они многообразны и отличаются междусобой модификациями, чувствительностью, длиной волны измерения,временем проведения реакции (временем инкубации). Каждый из них имеетсвои достоинства и недостатки. Однако всех их объединяет следующее: 1)раствор белка, используемый для определения концентрации, не может бытьвпоследствии использован для других целей; 2) для определения содержаниябелка в пробе, а, следовательно, его концентрации по данным оптическогопоглощения окрашенного раствора, необходимо построение калибровочногографика, по которому и определяется искомая величина.Калибровочный график для определения количества белка - этозависимость оптического поглощ ения раствора при определенной длиневолны от содержания белка в пробе (рис.
3). Для построения такогографика используют раствор белка - белок-стандарт - с известной, точноопределенной концентрацией. Как правило, в качестве белка-стандартаиспользуют легко доступные белки (бычий сывороточный альбумин (БСА),человечий сывороточный альбумин (ЧСА) и т.п.), точную концентрациюрастворов которых определяют спектрофотометрически по коэффициенту12удельного поглощения (для БСА: А28о°’1%=0,646, для ЧСА А28о°’1%=0,518(http://www.expasv.ch)). Однако в ряде случаев, например, для определенияконцентрации очень кислых или очень щелочных белков в качестве белкастандарта целесообразно использовать белок со свойствами, сходными сосвойствами анализируемого белка (см. ниже метод Бредфорд).A s 95hmм кг белка в пробеРис. 3.
Зависимость оптического поглощения при длине волны 595 нмот содержания белка в пробе. Калибровочный график для определенияконцентрации белка в растворе по методу Бредфорд.Калибровочный график, как правило, строят не менее чем по 5равномерно расположенным точкам. Для этого готовят пробы свозрастающимсодержаниембелка-стандарта,учитываяграницычувствительности конкретного метода измерения. Контрольная («нулеваяпроба») должна содержать все компоненты в нужном количестве и объеме, заисключением белка. График, как правило, должен выходить из началакоординат и иметь вид прямой.
Если эти условия не выполняются, проблемыскорей всего связаны с приготовлением проб.Поскольку интенсивность окраски раствора определяется не толькоконцентрацией белка, но также зависит от температуры и времениинкубации, реакцию во всех пробах (опытных и используемых дляпостроения калибровочного графика) необходимо проводить в строгоодинаковых условиях, желательно одновременно.Для того чтобы неизвестную концентрацию белка определить болееточно, её измерение лучше проводить в нескольких (не менее 3)«параллельных» пробах.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
