М.В. Медведева, Н.Б. Гусев - Определение концентрации белка в растворе (1123317)
Текст из файла
УДК 577ББК 28.072М42Рекомендовано к опубликованию решением Ученого и Учебно-методича ко,‘исоветов биологического факультета МГУ имени М.В. ЛомоносоваРецензенты:Гривенникова В.Г., кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимиибиологического факультета Московского государственного университетаимени М.В. ЛомоносоваЕвстафьева O.JI. , кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимииГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологическийуниверситет Федерального агентства по здравоохранению и социальномуразвитию.Медведева М.В., Гусев Н.Б.Определение концентрации белка в растворе: Учебно-методическоепособие.
- 2-е изд. - М.: Цифровичок, 2012. - 44 с.ISBN 978-5-317-03318-7Пособие в первую очередь предназначено для студентов 3-го курсакафедр биофизики, биоинженерии, иммунологии, физиологии человека иживотных, генетики и клеточной биологии и гистологии, выполняющихпрактические работы в рамках раздела «Современные методы биохимии».Оно также может быть полезно для обучения студентов других кафедрбиологического факультета МГУ, осваивающих навыки практическойбиохимии.Учебно-методическое пособиеМЕДВЕДЕВА Марина ВалерьевнаГУСЕВ Николай БорисовичОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА В РАСТВОРЕISBN 978-5-317-03318-7© Медведева М.В., Гусев Н.Б., 2010© Медведева М.В., Гусев Н.Б., 2012ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.......................................................................................... 4ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ВВЕДЕНИЕ................................................................................51.
С пектроф отометрические методы определенияконцентрации белка........................................................................................ 51.1. Спектрофотометрический метод определения концентрациибелка по поглощению в ближней ультрафиолетовой области(280 нм)...............................................................................................................61.2. Спектрофотометрический метод определения концентрациибелка по поглощению в далекой ультрафиолетовой области(205-240 нм).......................................................................................................
92. К олориметрические методы определения концентрации белка... 122.1. Биуретовый метод........................................................................................... 142.1.1. Макрометод.2.1.2. Микрометод.2.2. Метод Лоури и соавторов.............................................................................. 192.2.1. Стандартный метод.2.3. Определение концентрации белка с бицинхониновой кислотой......... 232.3.1. Стандартный метод.2.3.2. Микрометод.3. О пределение концентрации белка колориметрическимиметодами по связы ванию красителей.................................................... 263.1.
Определение белка по связыванию Кумасси (метод Бредфорд).......... 273.1.1. Стандартный метод.3.1.2. Микрометод.3.2. Определение белка по связыванию амидового черного (методШаффнера и Вайсмана).................................................................................314. Ф луоресцентны е методы определения концентрации белка.........334.1. Определение концентрации белка с флуорескамином........................... 344.2.
Определение концентрации белка с о/7/ио-фталевым диальдегидом ..37ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ........................................................................................ 39Семинар.................................................................................................................... 39Практическая работа..............................................................................................40ОФОРМЛЕНИЕ ЗАДАЧИ......................................................................................... 453СПИСОК СОКРАЩЕНИЙВСА - бычий сывороточный альбуминЬХК - бицинхониновая кислотаДМСО - диметилсульфоксидДСП - додецилсульфат натрияГрис - 3-гидроксиметиламинометанТрицин - трис(гидроксиметил)метилглицинХепес - Лг-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы’-этан-сульфоновая кислотаЧСЛ человеческий сывороточный альбумин')1'ТА - этиленгликольтетраацетат')ДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота4ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ВВЕДЕНИЕУмение правильно определить концентрацию белка (и, соответственно,его количество) - одна из наиболее важных задач на начальном этапеобучения биохимии.Существует множество методов определения содержания белка как врастворе, так и в других биологических материалах.
В данном методическомпособии мы ограничимся рассмотрением наиболее часто используемыхметодов определения концентрации белка в растворах.1.Спектрофотометрическиеконцентрации белкаметодыопределенияСогласнозаконуБугера-Ламберта-Бера(1)светопоглощение(абсорбция) или оптическое поглощ ение А (иногда оптическое поглощениеобозначается как D или Е) определяется соотношением междуинтенсивностью подающего (10) и прошедшего через поглощающий раствор(I) монохроматического излучения:A = lg (I o /I )(1)Величина А характеризует степень ослабления интенсивности света,пропущенного через раствор, и линейно зависит от концентрациипоглощающего вещества в растворе, толщины поглощающего слоя иоптических свойств поглощающего вещества в определенном растворителеи при определенной длине волны.
В свою очередь оптические свойствавещества характеризуются коэффициентом поглощения (коэффициентомэкстинкции) (2). Для того чтобы вещества было удобнее сравнивать междусобой по поглощающим свойствам, используют коэффициенты молярногопоглощения(молярнойэкст инкции).Коэффициентмолярногопоглощ ения (е) - величина оптического поглощения 1 М раствора при длинеоптического пути (I) (толщине поглощающего слоя) 1 см. Тогда величину Аможно записать как:гдеА = £• С* 1е - коэффициент молярного поглощения (М '^см '1)С - концентрация раствора (М)1- длина оптического пути (см)(2)Из формулы (2) следует, что, зная длину оптического пути и коэффициентмолярного поглощения (справочные данные), и измерив оптическоепоглощение, можно определить молярную концентрацию раствора.
Чемвыше величина коэффициента молярного поглощения, тем выше5чувствительность спектрофотометрического определения концентрациивещества.Часто, когда величина коэффициента молярного поглощения довольнобольшая, а концентрацию раствора удобнее определить в мг/мл, используюткоэффициент весового (удельного) поглощ ения А 0,1". Эта величинахарактеризует оптическое поглощение 0,1%-ного раствора (масса/объем) вопределенном растворителе при определенной длине волны.
Тогда поформуле (2), измерив величину оптического поглощения, можно определитьконцентрацию раствора в мг/мл, поскольку:0,1% раствор:0,1 г в 100 мл раствора, или0,001 г = 1 мг в 1 мл раствораКонцентрацию белковых растворов чаще определяют в мг/мл, используякоэффициент удельного поглощения.При измерении оптического поглощения следует помнить, чтодостоверными являются значения 0,2-0,8 единиц оптического поглощения(при очень малых и очень высоких величинах оптических поглощенийвелика ошибка измерения).1.1.
Спектрофотометрический метод определения концентрации белкапо поглощению в ближней ультрафиолетовой области (280 нм)Принцип метода. Метод основан на способности ароматических остатковаминокислот (триптофана, тирозина и в гораздо меньшей степенифенилаланина) поглощать свет в длинноволновой ультрафиолетовой областиспектра (вблизи 280 нм) (Рис. 1). Определенный (хотя и незначительный)вклад в поглощение при 280 нм вносят также дисульфидные связи.В связи с тем, что белки довольно сильно различаются по содержаниюароматических аминокислот, величина поглощения при 280 нм для растворабелка с концентрацией 1 мг/мл может варьировать в диапазоне от 0 (длябелков, не содержащих остатков ароматических аминокислот) до 4,0 (длянекоторых богатых тирозином белков шерсти). В среднем коэффициентыудельного поглощения белков составляют от 0,5 до 1,5. Поэтому, принятосчитать, что раствор «усредненного» белка (или смесь белков) сконцентрацией 1 мг/мл при 280 нм обладает поглощением, равным 1,0.Теоретически рассчитанные величины коэффициентов весового поглощенияиндивидуальных белков можнонайтив базе данных UniProt(http://www.expasv.ch ) или рассчитать по формуле:А 280 (мг/мл)= (5690 • nw+1280 • пу+120 • пс)/Мгде(3)А28о (мг/ мл) - коэффициент удельного (весового) поглощения(поглощение раствора с концентрацией 1 мг/мл)М - молекулярная масса белкаnw- количество остатков триптофана6пу- количество остатков тирозинапс- количество остатков цистеинаЦифры, стоящие перед этими членами, соответствуют молярнымкоэффициентам поглощения соответствующих аминокислот.£, М '^ с м 'Д ли н а волны, нмРис.
1. Спектры поглощения ароматических аминокислот (тирозина,триптофана, фенилаланина) в ультрафиолетовой области спектра.(http://www.carnpbell.edu/facultv/nemecz/323 lect/amino/imeges/spectrum.jpg).В том случае, если исследуемый образец белка содержит нуклеотидыи/или нуклеиновые кислоты, также поглощающие в ультрафиолетовойобласти с максимумом поглощения при 260 нм, концентрацию белка можноопределить, измерив оптические поглощения раствора при 280 нм (максимумпоглощения белка) и при 260 нм (максимум поглощения нуклеотидов инуклеиновых кислот) и используя эмпирическую формулу Калькара (4):С = 1,55 • Агво ~ 0,76 • А 260где(4)С - концентрация белка (мг/мл)А28о и А26о- величины оптического поглощения, измеренные при280 и 260 нм, соответственно7Для учета вклада нуклеиновых кислот и нуклеотидов можновоспользоваться измерениями оптического поглощения также при другихпарах длин волн и формулами (5) и (6), например:С - 2,51 • (А 235-А 280)илиС = 0,183 • А230 - 0,0758 • А260(5)( 6)Измерение оптического поглощения белкового раствора в ближнейультрафиолетовой области.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
